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(無題) 削除/引用 No.5097-6 - 2016/06/03 (金) 17:26:50 - ヤンマー みなさま 様々なアドバイス、ありがとうございました。 試行錯誤の結果、トリプシンを0.01％程度まで希釈し、 遠心を10％FBS RPMI or DMEMで行うことで無事接着するようになりました。 どうやら　おお　さんのおっしゃる通り、洗浄後2％血清で遠心しても完全に失活してなかったようです。私自身、失活していると思い込んでいたのですがまだ、活性が残っていたようです。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5097-4 - 2016/05/27 (金) 10:21:45 - おお 血清をつかってないなら、トリプシンインヒビターをつかって中和してください。

(無題) 削除/引用 No.5097-3 - 2016/05/27 (金) 10:20:22 - おお ちょっとよくわからないのですが、培地に血清入ってますよね、、、２％のプロトコールが見れますが、、、一度洗っているようなので血清があればなんとかなりそうな気もしますけど２％だと少ないんかなぁ。。。Lonzaのプロトコールはどうなってますか？

(無題) 削除/引用 No.5097-2 - 2016/05/27 (金) 00:32:04 - あqswでfrgthyじゅいこlp；＠ HUVECに限らず、血管内皮細胞はトリプシンにすごい弱いので普通の株細胞みたいな感じでやるとうまくいかないことあります。なので、トリプシン液も通常よりも薄いやつ使って、反応時間も最小限にして、中和も10%血清入培地とかじゃなくて、BSA+トリプシンインヒビター液とかで確実に速やかに反応止めてください。内皮細胞を販売してる会社のHPみれば、内皮細胞のトリプシン処理と中和これを使って下さいみたいな試薬があるので、それでやったほうがいいです。もしかすると舞子プラズマ感染とかみたいな他の原因もあるかもしれないけど。

HUVECの継代についてご意見いただけますか 削除/引用 No.5097-1 - 2016/05/26 (木) 11:13:31 - ヤンマー 4月から所属が変更になり新しく研究を開始しようとしています。 前所属でもHUVECを使用していたので今の所でも培養しようとしております。 液体窒素の凍結状態から起こしたときはコラーゲンコートしたプレートに接着し、増殖するのですが、一度、トリプシン処理を行うと接着せず、増えません。 前所属ではこのような経験はありませんでした。 継代・培養条件は以下の通りです。 PBS(-)/1mM EDTAで洗浄 ↓ 0.05% Trypsin/EDTAで処理　室温2-3分 ↓ 培地を添加し、細胞を回収 ↓ 800rpm 5min遠心し、細胞を回収、プレートに播種 コラーゲンコートはニッタゼラチンのものを使用、培地はLONZA EBM-2＋添加因子です。Trypsinは以前はGibcoのものを使用、現在は所属先にあったnacalaiのものを使っております。コラーゲン、培地は以前と同じです。 前回の培養時に播種前の細胞をトリパンブルーで染色したところ、特に傷害を受けた細胞も見受けられませんでした。 Trypsinによって細胞に合う、合わないはあるのでしょうか？ いろいろ考えてみたのですが、ほかに原因が思いつきませんでした。 アドバイスを頂けると幸いです。

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