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細胞染色時の4% PFA固定について教えて下さい。 トピック削除
No.5093-TOPIC - 2016/05/25 (水) 10:57:44 - アタコ
この度はお世話になります。ヒト培養細胞の小胞体をカルネキシン抗体染めたいです。
抗体はGeneTexというところから購入したrabbit pAbです。この抗体はwesternでは一本のバンドを出しますし、冷メタノール固定した培養細胞では核周囲が綺麗に染まる優秀な抗体です。

今回わけあって4% PFA固定した培養細胞を染めたいんですが、どうも染まり方が核周囲が染まっているようには思えず、冷メタノール固定の際の染色像とパターンが異なります。もちろんisotypeではシグナルは認められませんので抗体の特異性を見ていると思っています。

GeneTexのHPでは同じ抗体を使ってPFAで細胞を固定し、染めていまして、綺麗に像を出しています。

そういうわけで先生から4% PFA, 20 minというのは長すぎなんじゃないか？と言われ、長すぎるために本体の小胞体の構造が保てていないのでは？とご意見頂戴しました。

そこで質問させていただきたいのですが、4% PFAで単層の培養細胞を固定する際、20 min, 室温というのは長すぎで、これを10 minなどに下げることは可能でしょうか？最短でどれだけの長さをしておけば安心でしょうか？個人的に調べると20 minというのが最もよく使われているような気がしましたので、質問させていただきました。些細なことで恐縮ですが、どうしても4% PFAで染めたいので、どうかよろしくお願い致します。
　
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(無題) 削除/引用
No.5093-14 - 2016/05/26 (木) 00:40:44 - しろ
>[Re:1] アタコさんは書きました :
> 今回わけあって4% PFA固定した培養細胞を染めたいんですが、どうも染まり方が核周囲が染まっているようには思えず、冷メタノール固定の際の染色像とパターンが異なります。もちろんisotypeではシグナルは認められませんので抗体の特異性を見ていると思っています。

固定方法によって染まり方が違ってしまうことはあると思いますよ。そのプロテインには冷メタノール固定のほうが向いているのではないでしょうか。

> GeneTexのHPでは同じ抗体を使ってPFAで細胞を固定し、染めていまして、綺麗に像を出しています。

ということでしたらGeneTexに詳しいプロトコールを聞いたほうが確実ではないでしょうか。抗体はここから買っているのですから教えてくれるでしょうし。

(無題) 削除/引用
No.5093-13 - 2016/05/25 (水) 20:02:50 - MP
ちょっと気になりましたが４％PFAの溶液はPBSですよね？

(無題) 削除/引用
No.5093-12 - 2016/05/25 (水) 13:23:24 - AP
標的がレクチン様で糖鎖にくっついているすれば、糖も架橋するPLPは良い選択かもしれません。

(無題) 削除/引用
No.5093-11 - 2016/05/25 (水) 13:21:35 - AP
対比として他の小胞体マーカーの染色もやったほうがいいですね。

固定法もそうですが透過処理の条件で、特に膜タンパク質が流れてしまうことがあります。逆に透過不足で染まらないこともあります。0.05% Triton X-100と決め付けないほうがいいです。もっと薄くあるいは濃く、また界面活性剤の種類もTween-20、サポニン、ジギトニン、デオキシコール酸あるいは、有機溶媒系のアセトン、アルコールなど選択肢は多数あります。

PFAベースの固定法でも、膜や膜タンパク質をよく保持するレシピがあります。リン脂質はCa++, Mg++などの存在下でよく固定されるといいます。
例えば、PLP固定液、PFA in PEM (PIPES/EGTA/MgSO4)など。

(無題) 削除/引用
No.5093-10 - 2016/05/25 (水) 12:52:25 - toto
横からですが、聞かれておられる、-20度でのPFAの分注は推奨されているやり方です。濃いPFAを分注するのが一般的と思いますが、大差はないと思います。

ついでに、ホルマリン系での固定は遅く、室温で10分くらいだと特に可溶性タンパクは動く分子が多く残っています。また、おおさんが指摘しておられるように、リン脂質自体は固定できず、特に裏打ちのない小胞体の膜は細胞膜などに比べて壊れやすく、ホルマリンで1日固定していても、免染の過程で形が変わります。それでも、低い倍率であれば、どこに小胞体があるかの指標に用いるには簡便法で問題ない場合が多いです。

(無題) 削除/引用
No.5093-9 - 2016/05/25 (水) 12:47:52 - ANO
１〜３分で固定しています。

(無題) 削除/引用
No.5093-8 - 2016/05/25 (水) 12:05:54 - アタコ
おお様、重ねてお礼を申し上げます。

4%PFAを-20度保存というのは通常やられないのでしょうか？ PFAが幼児調整だということは昔キツく言われていたことなのですが、今いるラボがイメージングのラボで、そこではこのようにして保存していたので、それにならっています。

観察はconfocalではなく通常の顕微鏡でざっくりと観察しています。consistentな結果が得られればconforcalでちゃんとした画像を取得するというのがラボの流れになっています。

一度カルネキシン以外の小胞体タンパク質も染めてみることにします。

4% PFA, 10 minでも問題ないことを知って、質問してよかったなと思います。
みなさまありがとうございました。

(無題) 削除/引用
No.5093-7 - 2016/05/25 (水) 12:01:26 - アタコ
form様、

お礼を申し上げます。
PFAは質量分析用のMeOHフリーの16% PFA（市販品）を4倍に希釈（つまり終濃度4%）したものを-20度に一回分に小分け保存し、それを解凍したものを使用しています。（わかりずらい書き方ですみません。）

やはり10分で問題ないのですね。ありがとうございます。お聞きして本当に良かったです。
はい、膜透過処理は行っています。

(無題) 削除/引用
No.5093-6 - 2016/05/25 (水) 11:58:20 - アタコ
こんなに早くみなさまからご意見を頂戴することができ、とても嬉しいです。感謝申し上げます。

> それで染まって見えているのは正解なんでしょうか。
> PFA固定後の当処理はどんな方法で？

AP様、

確かに冷MeOHで染まる核周囲のものが正解なのか、、と言われると言葉がでません。細胞染色の経験はそれほどなく、小胞体は核周囲が染まるという偏見があると言わざるを得ません。大変有意義な気付きを与えてくださり、ありがとうございます。

4% PFA, 20 min固定後、 PBSで3回, 5 min洗浄しています。その後、0.05% Triton X-100入りの 1% BSA in PBS（以下 blocking bufferと呼ばせてください。）にて1 hrブロッキングを行った後、カルネキシン抗体やLAMP1抗体 in blocking bufferなどで染色しています。

(無題) 削除/引用
No.5093-5 - 2016/05/25 (水) 11:47:07 - おお
PFA溶液が古くなっているとか。。。

(無題) 削除/引用
No.5093-4 - 2016/05/25 (水) 11:44:18 - おお
核の周りが強く染まるとも限らなそうです。輸送中の小胞などにもあるでしょうか。どちらの固定で見ているのがもっともらしいかはわからないので、ほかのERマーカーなどをつかってシグナルが一致するかとかも見たほうがいいかもしれません。今フォーカルだとはっきり核の周りに強く見える用な感じにも取れるけど、どのような観察をしているのか。。。膜透過性処理はしてますか？してなかったらその処理でいくらか改善されるかも。逆にしていたら、、、膜タンパクをうまく固定できないで流れている可能性もあるかなぁ。。。



https://www.google.com/search?q=calnexin+antibody&safe=off&espv=2&biw=865&bih=395&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwiAnKnmmPTMAhUNVFIKHdTaCH4Q_AUIBigB

(無題) 削除/引用
No.5093-3 - 2016/05/25 (水) 11:33:18 - form
PFAの調製は上手くできていますか？
他の抗体の染色に問題はないでしょうか。
固定時間は10分で問題ないですし、膜透過処理を忘れてないですかね？

結局、PFAを使っても固定に寄与するのはformaldehydeなので、メタノールフリーのformalin溶液でもよい気もします。

(無題) 削除/引用
No.5093-2 - 2016/05/25 (水) 11:11:35 - AP
20分が10分になったところで劇的に変わるとは思えないのだが。

膜構造、膜タンパク質を保持する固定として、メタノールのような有機溶媒系は問題がある場合のほうが多いのだけれど。それで染まって見えているのは正解なんでしょうか。

PFA固定後の当処理はどんな方法で？

細胞染色時の4% PFA固定について教えて下さい。 削除/引用
No.5093-1 - 2016/05/25 (水) 10:57:44 - アタコ
この度はお世話になります。ヒト培養細胞の小胞体をカルネキシン抗体染めたいです。
抗体はGeneTexというところから購入したrabbit pAbです。この抗体はwesternでは一本のバンドを出しますし、冷メタノール固定した培養細胞では核周囲が綺麗に染まる優秀な抗体です。

今回わけあって4% PFA固定した培養細胞を染めたいんですが、どうも染まり方が核周囲が染まっているようには思えず、冷メタノール固定の際の染色像とパターンが異なります。もちろんisotypeではシグナルは認められませんので抗体の特異性を見ていると思っています。

GeneTexのHPでは同じ抗体を使ってPFAで細胞を固定し、染めていまして、綺麗に像を出しています。

そういうわけで先生から4% PFA, 20 minというのは長すぎなんじゃないか？と言われ、長すぎるために本体の小胞体の構造が保てていないのでは？とご意見頂戴しました。

そこで質問させていただきたいのですが、4% PFAで単層の培養細胞を固定する際、20 min, 室温というのは長すぎで、これを10 minなどに下げることは可能でしょうか？最短でどれだけの長さをしておけば安心でしょうか？個人的に調べると20 minというのが最もよく使われているような気がしましたので、質問させていただきました。些細なことで恐縮ですが、どうしても4% PFAで染めたいので、どうかよろしくお願い致します。
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