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(無題) 削除/引用 No.5085-13 - 2016/05/23 (月) 08:01:27 - おお 興味ある論文ありがとうございました。いろいろと今までの理解を更新していく必要もありそうです。

(無題) 削除/引用 No.5085-12 - 2016/05/23 (月) 05:54:04 - タグ おお様、重ねてお礼申し上げます。 酸性pHでのタンパク質の凝集を懸念して、EEA1の融合タンパク質に、monomeric CherryかmRFPを考えています。 一方、私も最近知ったのですが、ゴルジもどうも酸性（pH6.45ほど）のようですね。 nature.com/ncb/journal/v10/n10/full/ncb1773.html ”but none have been proven to be involved in luminal acidification of the Golgi.” この素晴らしい論文ではゴルジ酸性化を促すタンパク質を発現クローニングにて同定しています。 私が数えるすごく勉強になった論文の一つです。 ゴルジのpHはライソゾームやエンドゾームほどは低くはないようですが、このゴルジ局在タンパク質の機能低下ではタンパク質のトラッフィクなどにも影響がでるようですね。（論文の図より） 論文、ありがとうございます。目を通してみます。

(無題) 削除/引用 No.5085-11 - 2016/05/23 (月) 05:16:15 - おお ちなみにGFPのたぐいもpH感受性ですのでリソソームでは蛍光が弱くなってしまいます、ゴルジとかそんなにpH低かったでしたっけ、エンドソームの一部がプロトンポンプを活性化させ、内部を酸性にさせると思ったのですが。ただ私はこの領域にそんなに詳しくないので、もしよければ後学のためにもう少し詳細を教えていただけませんでしょうか。 酸性につよい蛍光タンパク質とのコンビネーションでプロトンポンプの活性化によるリソソームへの移行とか、エンドソームとリソソームの区別をやっているようなので、一度お調べになるといいでしょう。 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1299504/pdf/9512054.pdf

(無題) 削除/引用 No.5085-10 - 2016/05/23 (月) 03:32:00 - タグ おお様有難うございます。 そうですね、おっしゃる通りです。 私はあまりイメージングに精通していませんので、きちんと専門家の意見を聞くことが大事ですね。大変細かくアドバイスいただき、まことにありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.5085-9 - 2016/05/23 (月) 03:30:22 - タグ トピ主です。匿名様有難うございます。 Halo-tagという名前は聞いたことはありましたが、調べたことはありませんでした。 Promegaのサイトをみると、Halo-tagとHalo-ligandの相互作用はpH依存的のようですね。特にacidic pHでは結合が弱くなる、もしくは見れなくなるようでした。ゴルジやエンドゾームは酸性（pH5付近）だと思うのですが、そうなると影響が出てきてしまうかもしれませんね。それにしてもHalo-tagってGFPよりも大きそうですね。30kDaもあるのですね。教えてくださり有難うございます。 そうですね、もう一つはパルスチェイスをやればいいんですが、ボスが放射性同位元素を嫌う方で、その代替手段を考えていました。ですが、改めてパルスチェイスから得られる情報を予想し、提案してみようと思います。 > FlAsH tag等はタグの分子量が非常に小さいので立体構造の影響が問題になる場合は有利ですが、高特異性に標識するには条件検討が必要な印象です。 ありがとうございます。FlAsHタグについて、調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.5085-8 - 2016/05/22 (日) 08:15:29 - 匿名 Holo tag等の小分子を用いて標識するのはどうでしょうか？ 今はもっと良いのが出てるかも知れませんが、何れにしても、小分子を加えた時点で標識率が最大になるので、パルスチェイスのような実験を行うには適しているかと。 FlAsH tag等はタグの分子量が非常に小さいので立体構造の影響が問題になる場合は有利ですが、高特異性に標識するには条件検討が必要な印象です。

(無題) 削除/引用 No.5085-7 - 2016/05/22 (日) 06:10:10 - おお 顕微鏡によっていろいろできる範囲が違ってくるだろうと思いますので、何か蛍光蛋白を発現させてみて試してみるとか、顕微鏡屋さんに使おうとしている機種で考えている実験が可能かなど相談してみるといいでしょう。ばあいによってはその使い方に特化してデモしてくれる場合もあるようですし。

(無題) 削除/引用 No.5085-6 - 2016/05/22 (日) 05:08:10 - タグ おお様、引き続きコメントを記入頂き有り難う御座います。 広範囲のブリーチングが可能なのですね。 実際確かにそうなると蛍光標識した”新生”タンパク質が小胞体からゴルジその後、エンドゾームに行く過程まで追跡できますね。 VSV-G融合タンパク質にすると、小胞体にトラップしていた蛍光タンパク質が、32度でリリースされるので、よーいどん、と小胞の輸送を見やすくなるのではと考えていたからです。ブリーチの場合には新生タンパク質の翻訳を待たねばならず、そこに問題を感じていましたが、それほど問題にはならないかもしれませんね。 実際の実験系としては小胞輸送をsuper-resolutionの蛍光顕微鏡でライブで観察する予定です。 実験の目的を達成するためにはしっかりブリーチできていることが前提となるような気がします。

(無題) 削除/引用 No.5085-5 - 2016/05/22 (日) 04:01:22 - おお あなたの蛋白の挙動を示すのになぜVSV-Gをつけるのか未だによくわかりませんけど、、、あなたの蛋白にVSV-GーEGFPをつけるのがよくて直接EGFPをつけるのがなぜだめなのか。 たしかにタグをつけるとつけない場合と挙動が一緒か問題になるわけですが、それはわかっていることなので、確認実験を取りながら進めていけばいいのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.5085-4 - 2016/05/22 (日) 00:07:24 - おお >[Re:3] タグさんは書きました : > トピ主です。おお様、ありがとうございます。 > > FRAPやFLIPという方法ですよね。 > > 当初考えていたのですが、私の理解が正しければ、これは細胞内全てをブリーチするのではなく、ある特定の部位にレーザーを当てるのだと思うのですが、そうなると一つの細胞内に五万とあるエンドゾームを全てブリーチするのは極めて困難で、仮に特定のエンドゾームのみブリーチするとしても、みたいもの（vesicular trafficking）が見れるかどうか一抹の不安が出てきます。 一個、それか数個の細胞をブリーチングしてリカバリーを見ればいいのでは？リアルタイムで追うので全部をブリーチングする必要はないのかと。 Inverse FRAPとかいって細胞のあるオルガネラなどを狙って、そこだけ蛍光を残すというのもあるぐらいだし、細胞数個ぐらいのエリアはブリーチングできるんじゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.5085-3 - 2016/05/21 (土) 16:48:12 - タグ トピ主です。おお様、ありがとうございます。 FRAPやFLIPという方法ですよね。 当初考えていたのですが、私の理解が正しければ、これは細胞内全てをブリーチするのではなく、ある特定の部位にレーザーを当てるのだと思うのですが、そうなると一つの細胞内に五万とあるエンドゾームを全てブリーチするのは極めて困難で、仮に特定のエンドゾームのみブリーチするとしても、みたいもの（vesicular trafficking）が見れるかどうか一抹の不安が出てきます。もちろんFRAPなどでブリーチした領域に蛍光がリカバリされることはわかると思いますが、vesiculeがどこからきて、endosomeからどこに運ばれるのかを見る目的としては難しいかもという印象を持っています。ですが、もう少しきちんとFRAP、FLIPの可能性を考えてみます。ありがとうございます。 おお様はVSV-Gのシステムをご存知だと思うのですが、トピックを立てた後、何報かVSV-Gとの融合タンパク質を作っている論文にたどり着きました。VSV-Gの局在規定因子との兼ね合いなんかは作ってみないとわからないかもしれないですね。 >[Re:2] おおさんは書きました : > 蛍光タンパクであれば、フォトブリーチングをしてシグナルが出ない状況にすると、新たに合成されたその蛍光タンパクでタグをした物が現れて輸送される経緯が見れると思います。

(無題) 削除/引用 No.5085-2 - 2016/05/21 (土) 15:03:37 - おお 蛍光タンパクであれば、フォトブリーチングをしてシグナルが出ない状況にすると、新たに合成されたその蛍光タンパクでタグをした物が現れて輸送される経緯が見れると思います。

細胞内挙動追跡用のタグについて 削除/引用 No.5085-1 - 2016/05/21 (土) 14:07:22 - タグ エンドソームに輸送されるタンパク質の追跡を生細胞イメージングにて解析を行いたいです。 薬剤添加有無の比較、および遺伝子改変マウスより樹立した繊維芽細胞を使用予定です。 Floxed遺伝子改変マウスより樹立した繊維芽細胞にはRFP-EEA1を安定的に発現させています。 その後、アデノウイルス感染 (Cre) にてインビトロで遺伝子をノックアウトさせました。コントロールは感染なしのものを使用します。 GFPなどの標識タンパク質をタンパク質に付けるのも考えたのですが、厳密に挙動を追跡するという意味では難しいものがあると思います。できればよーいどん、で目的のタンパク質の挙動を小胞体やゴルジから、エンドゾームに移行するまでを追いたいんです。薬剤誘導性（DOX）のシステムでは発現に時間がかかりますし転写レベルでの制御になってしまうかと思います。また、タンパク質の安定化を変えるようなタグも同様に、転写、翻訳まで待たねばならず、それもいけないこともないかもしれませんが、決めあぐねています。 温度感受性VSVG-EGFPは正にうってつけのタグとして機能しそうですが、目的のタンパク質を融合させた場合、きちんとエンドゾームに運ばれてくれるでしょうか？どうも調べた論文の全てはVSVG-EGFPそのものの輸送を見ているようでした。ちなみにVSVGはpermissive temperatureで小胞体ゴルジから細胞膜へ輸送されます。このような実験を小胞体ゴルジからエンドゾームへ運ばれるようにするためには融合予定のタンパク質内にある局在規定配列の［強さ？］に依るのでしょうか？この配列が弱いと、VSVG-EGFPの本来の輸送（細胞膜へ）になってしまうのでしょうか？ 門外漢の分野でとんちんかんな質問をしてしまっているかと思いますが、経験豊富な皆様方からご意見をいただけますと大変嬉しく思います。宜しくお願い致します。

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