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ありがとうございます 削除/引用 No.5076-7 - 2016/05/20 (金) 11:18:15 - ラスカル よっしー様 書き込みありがとうございます。 説明が下手でもうしわけございません。 CD4のほうは１次抗体の後に蛍光が付いた２次抗体を反応させて綺麗に見ることができました。 ペルオキシターゼの失活はアジ化ナトリウムを使用されていたのですね。 勉強になります。

(無題) 削除/引用 No.5076-6 - 2016/05/20 (金) 10:02:54 - よっしー マウスの大腸の凍結切片をCD4(GK1.5)とCD8(53-6.7）を用いてDABでよく染色していましたが，賦活化無でアセトン固定のみで問題なく染色出来ました． しかし，蛍光標識１次抗体だとシグナルが弱いように思います． 参考までにさんのおっしゃるように，ビオチン標識2次抗体を使うか，せめて蛍光標識2次抗体を使うと検出できるような気がします． 内因性ペルオキシダーゼの失活は0.3%過酸化水素+0.1%アジ化ナトリウムを用いて特に問題にはなりませんでした．

ありがとうございます 削除/引用 No.5076-5 - 2016/05/20 (金) 09:51:14 - ラスカル 皆様アドバイスありがとうございます。 参考になれば様 アドバイスありがとうございます。 パラフィンのほうで出た抗体は抗体の添付書類にもIHC-Pでは加熱処理が必須になっていた抗体でしたのでとりあえずはパラフィンブロック加熱処理ではDAB発色で発現を確認したのですが、凍結ブロックでは固定をアセトンまたはメタノール固定でおこなっているため加熱処理はするのは違うかなと思い、加熱処理はせずに凍結切片でCD4との2重染色にもっていっています。このときにCD4の発現はみられるのですが、もうひとつの抗体は発現がみることができない状態です。 アドバイスの増感の方法も検討してみたいと思います。 おお様 ご指摘ありがとうございます。 negative controlはとっておりそちらでは発現見られなかったのですが、同じ手法で蛍光染色にもっていくと全く見えないのでDAB発色の結果を疑っていました。 ネガコンとっていたことすらすっかり忘れていました。 この場合DABの結果より蛍光の2次抗体がだめになっていることをうたがうべきでしょうか？ こちらの保存はー20度に遮光分注しており解凍後は4度に遮光保存しております。 購入したのは6年くらい前です。 組織様 アドバイスありがとうございます。 やはり凍結切片でも加熱処理をすることもあるのですね。 今回凍結切片の固定が冷アセトンまたは冷メタノール固定で行っています。（ホルマリンやPFAでは自家蛍光が強くなり上手く自家蛍光を消すのが難しくおこなっていません。） 特にアセトン固定はなぜか加熱処理を加えるとはがれやすい傾向があるように感じているのですが、いかがでしょうか？ ペルオキシターゼの件はDAB発色の場合です。

(無題) 削除/引用 No.5076-4 - 2016/05/20 (金) 08:51:48 - 組織 凍結切片でも、核内抗原の検出には加熱処理が必要なことがあります。 ペルオキシダーゼブロックの話はDAB検出に関してですよね（蛍光では不要）？ 内因性ペルオキシダーゼの影響を見るのであれば、一次抗体と二次抗体をスキップして、DABを反応させてみればわかります。 個人的には、0.3％過酸化水素／メタノール処理はやや弱い印象を持っています。

detergents 削除/引用 No.5076-3 - 2016/05/20 (金) 02:51:01 - おお >また、凍結切片でDAB発色で行ったときは加熱なしでも発色がみられたのですが、この結果が正しいのかどうか疑わしく思いはじめました。 >消化管の凍結切片は内因性のペルオキシターゼの影響が出やすいと思いますが、こちらは0.3％過酸化水素／メタノール処理で対応できるのでしょうか？ いずれにしろコントロールを取らないといつまでたっても疑わしいと思うかもしれません。

参考になれば 削除/引用 No.5076-2 - 2016/05/19 (木) 23:07:16 - 参考になれば まず、凍結切片を加熱処理したら切片がスライドが剥がれるか粉々になんってしまうかと思います。ですので、お勧めできません。 CD4に関してですが、私が知るか限り、特殊な固定と包埋方法を用いない限りパラフィン切片では染まりません。ラットのCD8は圧力なべで賦活化(漢字が間違っているかもしれません・・・)して何とか染まりましたが、CD4はラットでもマウスでもダメでした。 私の経験上、凍結切片で染まってパラフィンで染まらないということはありますが、パラフィンで染まって凍結切片で染まらないということはまずないです(言い切っていいのかわかりませんが・・・)。 CD4に関しては、二次抗体を用いた系で染めているかと思います。 もう一つの方に関しては、一次抗体の動物種が何を使用しているかわかりませんが、シグナルを増幅できる系を考えてみてはいかがでしょうか？二次抗体にbitoin付きにして、それをstreptavidin-Alexa488と反応させてみるとか？ あるいは、これも一次抗体の動物種により使えない場合もありますが、ゼノンという抗体のラベリングシステムにより一次抗体をAlexaでラベリングしてみるのもよいかもしれません。ゼノンは二次抗体をかませて発光させたものよりも明るいかと思います。 検討、祈ります。

凍結切片での免疫染色について 削除/引用 No.5076-1 - 2016/05/19 (木) 14:12:15 - ラスカル 凍結切片での免疫染色についてお尋ねいたします。 マウスの大腸で凍結ブロックを作って蛍光2重染色を試みております。 片方はパラフィンブロックでは条件を検討し、パラフィンブロックでは加熱処理が必須でした。もうひとつの抗体はCD4でパラフィンブロックではどうしてもうまくいかず、凍結ブロックで発現は確認しております。 それで、凍結のブロックで両方発現させたいのですが、パラフィンで加熱処理した抗体のほうが蛍光でみることができません。 蛍光抗体はAlexa594を使用しております。 凍結ブロックなので基本的には加熱は不要であると思いますが、このような場合加熱してみてもいいのでしょうか？ また、凍結切片でDAB発色で行ったときは加熱なしでも発色がみられたのですが、この結果が正しいのかどうか疑わしく思いはじめました。 消化管の凍結切片は内因性のペルオキシターゼの影響が出やすいと思いますが、こちらは0.3％過酸化水素／メタノール処理で対応できるのでしょうか？ 何かアドバイスがいただければと思います。 よろしくお願いします。

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