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(無題) 削除/引用 No.5073-8 - 2016/05/18 (水) 16:12:43 - おお >トランスフェクトした細胞ではほとんど赤く染まらない 細胞が死んで浮いてきてほとんど接着してなくすててしまってるってぱたーんかな？

(無題) 削除/引用 No.5073-7 - 2016/05/18 (水) 16:06:02 - mon ＞導入効率が非常に悪く3-4割です。 何で導入効率をみているかわかりませんが、「3-4割」ならかなり良い方と思いますが、歳かな。。。 検出できないとのことですが、遺伝子導入された細胞が死んでいるという可能性はないですか？例えば、GFP遺伝子と共導入したら、GFP-positive細胞が浮いているとか？

(無題) 削除/引用 No.5073-6 - 2016/05/18 (水) 16:01:07 - おお いや全体的には難しいと言ってませんけどね。。。ポンソーで染まらないのはトランスフェクションの効率以前の問題だと思いますが、、、細胞数が少ないんですか？ たいてい6-well plateで200 ulのライシスバッファーをつかったら、Lysisが不完全な状態かもしれませんけど、それでもポンソーで染まらないのはへんだなぁ。。。

(無題) 削除/引用 No.5073-5 - 2016/05/18 (水) 15:51:58 - AP >いずれも培養上清の濃縮のような感じでした。ライセートでも可能な方法で手軽にだれでもできる方法ありましたら教えてもらえないでしょうか？ そんなことはない。むしろライセートのサンプルに適用する機会のほうが多いと思います。 ただし、単純に濃縮してしまうとオーバーロードになって分離も検出もうまくいかなくなる可能性があります。なにかしらの分画をしたほうがいいでしょう。 そのタンパク質の局在などはわかっているのでしょうか。糖鎖をもつタンパク質なので、膜タンパク質か分泌タンパク質でしょうか。膜画分をとるとか、小胞を集めるとか。最初に核を除いてそれ以外（細胞質、膜）にするでも有効です。 細胞画分をとるためのキットなんかも売ってるみたいです。

(無題) 削除/引用 No.5073-4 - 2016/05/18 (水) 15:46:19 - 李1 おお様ありがとうございます。 泳動後にポンソーS染色してるんですが、トランスフェクトした細胞ではほとんど赤く染まらないんです。293Tは10 ugを載せていますが、綺麗に染まります。 6-well plateを200 ulのライシスバッファーでとかしていますが、濃度が薄いんだと思うんです。5-10倍乗せたらきっと・・・・・と期待しています。 やはりそうなんですかー。ライセートの濃縮は難しいんですね・・ IPなら可能ですね！！ぜひ検討してみます。ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.5073-3 - 2016/05/18 (水) 15:41:47 - おお ECLのきっとも弱いのからかなり強いものまであるのでその辺も選択肢がありそうです。

(無題) 削除/引用 No.5073-2 - 2016/05/18 (水) 15:40:14 - おお TCA沈殿、アセトン沈殿は細胞のLysatesでもやれることはやれます。リカバリーがアグって難しいこともありますけど。硫安沈殿もできないことはないですけど、沈殿を溶解したあとかなりまだ硫安が残っていて透析をかませないと行けないかなぁという気がします。 まあアプライの量を増やすと言っても上限がありますからそのサンプルを５倍の濃度にして同じ容量のせてうまくいくかわかりません。 ライセートの工夫でも多くのターゲットが工夫ができますけど。例えば膜タンパクだと膜だけ回収するとか。 最後の手段としてはIPしてもいいんじゃないですか？

ライセートの濃縮方法 削除/引用 No.5073-1 - 2016/05/18 (水) 15:04:36 - 李1 ウエスタンブロットに格闘中です。 マウス皮膚線維芽細胞の初代培養細胞にある遺伝子が入ったプラスミドをトランスフェクションしました。その遺伝子から作られるタンパク質のでき方を、WTと糖鎖修飾ができないマウスからの細胞間で比較することが本研究の課題です。 結論からいいますと導入効率が非常に悪く3-4割です。遺伝子にはN末に3連Mycタグが付いており、感度を上げるような工夫はしてあるんです。3-4割だと見えてもいいような気もするんですが・・・ウイルスは許可がないので、作製できません。 上司からは、導入効率をあげることもそうだけど、まずはSDS-PAGEにアプライする量を増やしてみよう、とのことで今回できるだけたくさん載せましたが、それでも見たいものは見えませんでした。かすかに見える程度です。293Tに導入するともちろんバンバン見えます。 タンパク質（80 kD）を濃縮できればと思いますが、1% Tryton X-100で壊したライセートを濃縮はできるんでしょうか？過去の題目を検索するとTCA沈殿、アセトン沈殿、硫安沈殿などがヒットしましたが、いずれも培養上清の濃縮のような感じでした。ライセートでも可能な方法で手軽にだれでもできる方法ありましたら教えてもらえないでしょうか？

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