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(無題) 削除/引用 No.5068-8 - 2016/05/18 (水) 23:51:30 - くぁswでfrgtひゅじおlp 蛋白質Xの蛋白質レベルでの発現量が大体同じくらいかどうか、Westernで調べてみるといった確認はしていますか。もしサンプルがまだ残っているならば抑制がかかるときとかからないときの蛋白質Xの発現量をwesternで比べて見て下さい。発現量に違いがあるということはないでしょうか。 transfection効率や、time pointや増殖状態など（文章では書きにくいちょっとしたことで）の違いで発現量はかなり動く場合もあるとおもうので、プロトコルに従えばうまくいくというものでもないので、自分で気になる点は書いてなくても実験で慎重に確認しながら進めると以外とうまくいきます。 発現量が実験間で安定しないようなら、他の人が言うように、少々時間はかかりますが、難しい事は無いのでstable作るのが長期的にみたら得策とおもいます。

(無題) 削除/引用 No.5068-7 - 2016/05/18 (水) 12:34:26 - protein トランスフェクション効率と発現量が原因ということであれば、 目的遺伝子とGFPを共発現させるようにしつつ細胞内サイトカイン染色を行えば、 発現細胞におけるサイトカイン産生が評価できるかもしれないですね。

(無題) 削除/引用 No.5068-6 - 2016/05/18 (水) 04:50:40 - おお タンパクXの既存の作用を毎回モニタリングすることでファンクショナルな面でうまく行っているかどうか評価できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5068-5 - 2016/05/18 (水) 04:07:19 - CD どんなマシンを使っているかにもよると思いますが、NucleofectorでJurkat細胞に遺伝子導入しようとすると実験ごとに導入効率がかなり違うことを経験しました。InvitrogenのNEONはわりと一定でした。 Transfection効率をGFPで見ていましたが、GFP発現が30％〜70％くらいまで結構ばらつきましたし、Viabilityもかなり上下しました。細胞のコンディションによるところが大きい印象だったので、まじめに細胞数をカウントして良い条件で培養→Transfectionすることで安定したなと感じていました。 私の実験ではポジコンが欲しかっただけのTransfection実験だったので効率はあまり問題にならなかったのですが、本実験としてのデータがほしいのであれば毎回GFP発現プラスミドでTransfection効率をモニターしたほうが良いのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5068-4 - 2016/05/18 (水) 01:05:25 - おお puromycinやblasticidinなら一日ぐらい作用させると耐性プラスミドを持っていない細胞は死んでしまうので、そういうマーカーをもった発現ベクターか、マーカーベクターを十分の一ていど混ぜてトランスフェクションして、セレクションマーカーを加えてプラスミドが入った細胞を濃縮することは可能のようです。一日処理後、通常の実験と同じようにやればいいようですけど。

(無題) 削除/引用 No.5068-3 - 2016/05/17 (火) 16:40:58 - N おお様 早速ありがとうございます。 ＞抗CD3抗体（固相）および抗CD28抗体（液相） ＞二種類実験があるのか？ならばどっちがどうなのか、、、 混乱させてしまう書き方で申し訳ございません。 抗CD3抗体と抗CD28抗体で同時にT細胞刺激を行っています。 ＞タンパクXの発現は毎回確かめてますか？ ＞導入方法はエレクトロポレーション以外は無理ですか？ 毎回WBにより発現を確認しており、少なくとも発現していることは確認できています。実験間でのtransfection効率まで精査しておりませんので、もしかしたらそこが問題なのかもしれません。 安定発現細胞株に関しては、とあるタンパクXはtoxicに働くらしく、stableの樹立は断念しております。発現誘導株に関しては、考えたことがなかったので一つの解決策とさせて頂きたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5068-2 - 2016/05/17 (火) 16:07:31 - おお ＞抗CD3抗体（固相）および抗CD28抗体（液相） 二種類実験があるのか？ならばどっちがどうなのか、、、 タンパクXの発現は毎回確かめてますか？発現のぶれか、意外と発現量が低すぎるから、効果があるかないかのところで実験しているとか。その他細胞のViabilityとかいろいろなパラメーターがあると思いますけど。 または入ってない細胞がサイトカインを出したりすることによって入っている周りの細胞を刺激しているとか。 導入方法はエレクトロポレーション以外は無理ですか？ どうしてもばらつきが改善されないなら発現誘導できる細胞を作ってから実験してはどうですか？またはステイブルに発現する株とか（ステイブルの場合は発現により細胞が変わるようだとまずいでしょうけど）。

とあるタンパクXによるサイトカイン産生抑制が実験間で異なる 削除/引用 No.5068-1 - 2016/05/17 (火) 15:50:02 - N いつもこのフォーラムでは勉強させて頂いております。 本日は、トピックの件について皆様からご意見を伺いたく投稿いたします。 現在、Jurkat細胞を用いて、とあるタンパクXを一過性に発現させた際のサイトカイン産生に与える影響を調べています。 とあるタンパクXの一過性発現により、T細胞刺激に伴うサイトカイン産生を抑制することがみられていますが、実験間によってその抑制が全くみられないこともあります。 実験手順は、 �@electroporationにより、transfectionを行う。 �Atransfection後、抗CD3抗体（固相）および抗CD28抗体（液相）でT細胞刺激を行う。 �BO/N培養後、ELISA kitによりサイトカイン産生の測定を行う。 transfectionを行うプラスミド量、抗CD3抗体および抗CD28抗体量、transfectionからT細胞刺激をかけるまでのincubation時間、T細胞刺激時間の４点については最適化出来ていると考えています。 回数としては、どちらも１：１という感じで、タンパクXを発現させないコントロールにおけるサイトカイン産生量は実験間で再現性がある一方で、抑制がみられた実験間において、とあるタンパクXを発現した際のサイトカイン産生の抑制率も再現性があります。 このことから、実験間のバラつきと結論付けるのは少し諦め難いところです。 単に、実験が下手なだけかもしれませんが、T細胞系統を用いてサイトカイン産生の測定をされた際に、同じような経験をされた方や、tipsなどお持ちの方がいらっしゃいましたらアドバイス頂けませんでしょうか。 どうぞよろしくお願い致します。

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