どの程度系がワークしているかはそばで見てみないとわかりませんが、あまりワークしてない系でも簡単なコンストラクトはできることがあるので、その系で難しいインサートとプラスミドの組み合わせでやると全く入らなかったりして、それでも系がワークしていると思いこんでいるため全く解決しないケースはまあまああります。
市販のコンピを使っているなら保存状態さえ良ければそこは問題ないと思います。Infusionは効率はよくわかりませんが、反応後のプロダクトを電気泳動したりして確認する手は取れなくはないと思いますが、、、うまくいくポジコンと比較してみればわかりやすいかもしれません。
コンピの選択ですが、PCRプロダクトをつかうので制限システムが抑制されているものを使うと効率が上がるかもしれません。XL1 Blue MRF'、TOP10、DH10Bなどでしょうか。mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)とか mcr, hsdがいじられた株を調べてみるといいかと思います。 Mach1はhsdR(rK- mK+)がありますけど、使ったことがないのでちょっとよくわかりません。k株でなくって、w株のようですね。
プラスミドを見てみました。おっしゃるようのLacZの発現ができるようになっているみたいですね。もし気になるなら、思い切ってLac promoter の上流 BxtX1から挿入してみてもいいのかもしれません。Lac promoterあたりで大腸菌で双方向にプロモーター活性があるようにしているようなので、Kan耐性のプロモーターがどこにあるかちょっとわからないので、そこを調べてからになるかもしれませんけど。
色々ストラテジーはあると思いますが、入りにくい場合はやはりクローニング専用のベクターにいれて移しかえるのはある意味無難ですので、並行してやってみればどうでしょうか。効率にどのように作用するかわかりませんがAmpのベクターにInfusionでつかう配列を含みクローニングすると、プラスミドを混ぜてインサートの転移ができそうな気がします（ちょっと冒険かもしれませんけど）。
もしコピー数を制限したいというのであれば、温度もですが、カナマイシンの量も減らすことができます。もちろん併用してもいいでしょう。１２。５µg/mLぐらいまで下げれると思いますが、菌株によるかもしれませんので、一度トランスフォーメーションしてないものをまいてみて濃度を決めるといいかもしれません。 |
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