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(無題) 削除/引用 No.5056-6 - 2016/05/17 (火) 20:00:44 - asan ちなみに、良く間違われるんですけど、もともとStratageneで売ってた一周かけるSite directed mutagenesis のやり方(DpnIで処理する方法）は、厳密にはPCR(chain reaction)ではなく、毎度鋳型からでしか増えないので2Nでしか増えませんので、初期のエラーが対数的蓄積はしないです。とはいっても、エラーがないことを保証はしませんが、自分の経験上変異付近で数塩基飛んだりすることはタマーにありますけど。 結論で照ると思いますが、まあ発現ベクターなら全長のorfぐらいは最低読み直すでしょうが（変な点変異があると実験結果は問題なくても後で困るので）、それ以外の部分は使えれば良いとする場合が多いともいます。これが、重要な実験だったり後で変な状態になってたら困るマウス用のコンストラクトとかなら横着しないで全部確認するとは思いますけど。 まあ、pEnterみたいなので走らせるほうが確実ではありますね。

ありがとうございました。 削除/引用 No.5056-5 - 2016/05/13 (金) 08:37:48 - SDM みなさま、ご回答ありがとうございました。 勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.5056-4 - 2016/05/12 (木) 06:01:35 - si 一般的には、PCRサイクルを5回程度に低く抑えてPCRエラー産物を極力持ち込まないというのは大前提として、気になるようなら中年さんが仰ったとおりにバックボーンのプラスミドにまた載せ替えて上げるのがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5056-3 - 2016/05/11 (水) 22:18:28 - おお 大腸菌のマーカ（アンピシリん耐性とか）、oriは大腸菌からプラスミドが取れる時点で機能しているので取れてきたプラスミドはそこに変異が入っていて機能しているわけですよね。 発現は実際にトランスフェクションして発現が確認されれはそこは機能しているので、そこに変異が入っていても発現させる機能があることになりますよね。 で、問題はあなたの実験でどこまでオリジナルのプラスミドの配列が忠実でなければ行けないかですよね。ほんとにそこが重要であれば、読んだ配列の部分をオリジナルのベクターに入れ直すというのもやっている方がいらっしゃるかと思います。 もう少しラフには、複数のクローンで発現させてみて、逸脱したものは何かクリティカルな変異が起こっている可能性を考えて使わないということも一つのやり方かと思います。

(無題) 削除/引用 No.5056-2 - 2016/05/11 (水) 22:08:26 - 中年 Gatewayではありませんが、シークエンスが確認された領域のみを、通常のサブクローニングの方法で正常型プラスミドの相当する領域と置き換えて変異型プラスミドを構築しています。

Site-directed mutagenesis 削除/引用 No.5056-1 - 2016/05/11 (水) 21:38:36 - SDM Site-directed mutagenesis (SDM)によってExpression vectorに直接的に変異を導入する場合、目的の遺伝子以外の領域にもPCR由来のエラーが入る可能性があると思います。みなさまは、この問題についてどのように対応しておりますか？ Plasmidの全配列をシーケンスでチェック？それとも無視？あるいは何か良い方法でこの問題を解決しているのでしょうか。ご教授の程、何卒お願い申し上げます。 なお、これまで私は、pENTRなどのGatewayエントリークローンに対してSDMをして、それをLR反応で発現クローンに組換えておりました。

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