些細なことなのですが、質問させてください。
マウス肝臓を細かくしたのち酵素処理してシングルセルを得ました。
これをF4/80で染めて、クッパー細胞をセルソーターを用いてソートし、RNA抽出を行いたいです。問題は、40サイクル回しても、 GapdhのPCRアンプリコンが認められませんので、回収率は極めて低いのではと思います。
方法としては以下の通りです。確認していただけませんでしょうか？
A. Fcブロッカーで反応させた肝シングルセルを氷上でPE-anti-F4/80で染める。
B. 1% FBS含有PBSにて細胞を洗浄
C. セルソーターに供して目的のpopulationを定める。
D. 15 ml tubeにあらかじめ完全培地を5 mlほど入れ、内面を濡らしたことを確認したのち、そのtubeへソートする。毎回、5x10E5ほどをソートしています。
E. 細胞を800xg, 5 minで遠心後、上清を除く
F. QiagenのRNAeasy mini kitの手順書通りにRNA抽出を行う
G. 無駄だとは思うのですが、一応eluateをnanodropで測定
結果、RNAの吸光度は得られず、そのままRTに進み、40サイクルPCR反応後のGapdhを電気泳動しても、bandは認められませんでした。ポジコンのcDNAを使用した際には得られていますので、PCR反応には問題はありません。
今考えていることとして、ソートされた細胞を直接QiagenのRLT buffer (beta-ME直前添加済）にはいるようにするか、ソートする細胞数を増やすことの二つです。
私個人的な意見としては、5x10E5をソートしたからといって、最悪10%くらいしか生きている細胞として回収できていないのかもしれません。というわけで過去のスレッドを見ると、Qiagen Mini kitよりは、Qiagen Micro kitの方がいいのかもしれないです。
ですが、上司から、トリゾールでソートされた細胞を受けるのではいけないのか？と聞かれました。確かにトリゾールの場合には、ゴリコーゲンをキャリアとして用いることができると思います。おそらくですが、このQiagen Midi kitは抽出効率というよりは簡便で精製度の高いRNAが得られるというだけで、収率には期待できないのではないか？と思えてきました。
トリゾール/グリコーゲンを使う方法、もしくはQiagen Micro kitに切り替えるかのどちらがいいでしょうか？ご教授お願いいたします。
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