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(無題) 削除/引用 No.5052-12 - 2016/05/11 (水) 08:57:29 - おお >トリプシンEDTAは個人的にはあまり気になりませんけど、 これは培地に血清が入っている場合に限ってです。無血清培地を使っているなら慎重に洗ってください。トリプシンインヒビターなどを使うこともあるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.5052-11 - 2016/05/11 (水) 08:10:44 - しろ 当方も以前さいぼーさんと同様に節約のためフラスコで長期間培養しておりました。経験的に、確かに細胞の見た感じ、なんとなく細胞凝集が増えたような感じがする、細胞接着の感じが違う気がする、ということは感じておりました。ただこちらでも軽く検索してみましたがきちっとした論文等みつかりません。みなさん経験的に再利用は避けている、といったところだと思います。フラスコを販売している会社には資料ないでしょうか？（売るために再利用の推奨はしてないでしょうが・・・）普段の節約を考えるのであればフラスコでなくてもペトリディッシュの使用で節約はできると思います。 ご使用の6-ウェルプレートは接着細胞用でしょうか。あとはトリプシンを除去しないのであれば、浮遊を確認して培地を加えたのちにピペッティングを何度かして細胞をばらばらにし、少なめの細胞数を6ウェルにうえて、少し大目の培地で2日ほど培養してから実験スタートするのはいかがでしょう。少なめの細胞数から増殖したところからスタート、と。

(無題) 削除/引用 No.5052-10 - 2016/05/10 (火) 23:59:32 - おお トリプシンEDTAは個人的にはあまり気になりませんけど、というか、細胞の飼い方はそのラボで教えてもらって、その方法で今まで飼われていたんじゃないかな、、、 まあそのへんはよくわからないにしても、気になるなら遠心して除いてもいいでしょう。であまり変わりがないというなら、そこでもう一度考えてみるといいかもしれません。 剥がれやすい状態になったところで、トリプシンEDTAをアスピレーターで除いてから培地をかけて懸濁する人もいますね。 ２４時間後で細胞があまりちゃんとくっついてない感じなら細胞が撒いたときにすでに調子が悪い可能性もありますし、４８時間後でも剥がれやすいというなら細胞が変わっているのかもしれません。 細胞によっては２４時間ぐらい表面に安定してつくのに必要なものもありますけど、そうであれば撒く日は朝一にやって、翌日午後に実験を始めるとか工夫してもいいかもしれません。 それと、経験のある人にPBSで洗う前とか、随時細胞を見てもらった方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.5052-9 - 2016/05/10 (火) 23:34:14 - たていす あなたの使っているフラスコは、プラスチックのフラスコですか、それともガラスのフラスコでしょうか？ ガラスのT型フラスコは、再利用するだろうと思いますが、どうなんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.5052-8 - 2016/05/10 (火) 19:24:10 - モモ O/Nって何時間ぐらいですか？ 24時間待ってもはがれますか？

(無題) 削除/引用 No.5052-7 - 2016/05/10 (火) 18:22:31 - 中年 トリプシンは血清中のインヒビターで十分に阻害されているから、気難しい細胞でなければ微量のトリプシンの持ち込みは気にしないで植え継ぐことは珍しくないと思いますよ。フラスコを使い回すことについてはわかりませんが。

(無題) 削除/引用 No.5052-6 - 2016/05/10 (火) 17:06:03 - さく むかーし似たような事を考えてやってみたことがあります。Helaだったと思いますが、3〜4回同じフラスコを使って交換という感じで実施したところ、継代を開始して1か月ぐらいで細胞凝集が増えたような気がして、廃棄しました。トリプシンなら血清で中和されるわーとか思いながら始めたんですが、やっぱり一般的な手法をとらないということは、何らかのリスク（コンタミ、形質が変わる、再現性が取れない…などなど）の可能性が高いと考えて止めました。

(無題) 削除/引用 No.5052-5 - 2016/05/10 (火) 16:37:35 - み >[Re:3] さいぼーさんは書きました : > はい！トリプシンEDTAで処理しておりまして、浮遊を確認したら培地を加えたのち、《遠心せずに》1/10ほどを新しい培地に接種しています。 > > 遠心したほうがいいですか？それも原因でしょうか？？ 遠心してないのも気になりますが、さらに問題視しているのはフラスコに残存しているトリプシンEDTA溶液の除去はどうしているのかということです。 PBSなどで何回かフラスコ内を洗浄されているのですか？ していないならかなりの量のトリプシンが未だ作用しつづけるでしょうね。 その厳しい先生とやらに御自身が行ったプロトコールを提示しつつ、残存トリプシンの影響についてどのようにお考えなのかを相談されると良い。

(無題) 削除/引用 No.5052-4 - 2016/05/10 (火) 16:35:51 - おお 10cmディッシュとかにするとコストが下がるから、１ヶ月も同じもので飼わなくてもいいんじゃないかな。 細胞の性質が変わったかどうかはよくわかりませんが、そんなドラスティックに変わるかなぁという気もします。そもそもフラスコを再利用しなかった場合は、剥がれなかったんですか？その細胞は今まで同じように使い古しのフラスコで何度も継代されているヒストリーを持ってませんか。そのラボにあった細胞ですよね。 PBSで剥がれやすいなら、マグネシウム、カルシウム含有PBSなど使うと防げるかもしれません。あまりその細胞は昔の経験からしてはがれにくいなあと思ったことはないですけどね。。。洗うときにWellの底が乾いてきているとかないですか？

(無題) 削除/引用 No.5052-3 - 2016/05/10 (火) 15:13:43 - さいぼー はい！トリプシンEDTAで処理しておりまして、浮遊を確認したら培地を加えたのち、《遠心せずに》1/10ほどを新しい培地に接種しています。 遠心したほうがいいですか？それも原因でしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.5052-2 - 2016/05/10 (火) 15:00:52 - み フラスコからはがす方法は何を使用されていますか？ トリプシンEDTAなら、その残存は皆無の状態にされてから再利用しているのか疑問。

細胞培養容器の繰り返しの使用 削除/引用 No.5052-1 - 2016/05/10 (火) 14:28:03 - さいぼー こんにちは。細胞培養を初めて１ヶ月が経ちました。 HepG2という細胞でして、T25フラスコとかT75フラスコで飼っております。 厳し〜い女性スタッフの先生から、フラスコは繰り返し使えるから捨てないように、と言われており、一ヶ月を同じ容器で買い続けています。 この細胞を6-ウェルプレートにまいて、オーバーナイト後、 温めたPBS 1mlで優しく洗っているんですが、ほとんどの細胞がはがれます。 そこで質問なのですが、使い古しのフラスコで長期培養した細胞は、例えば細胞外マトリックスの分泌が低下していたり、接着分子の発言が低下しているなどの表現形の変化というのは、細胞が剥がれる原因として考えられますか？ 現時点で原因はわかりませんが、使い古しのフラスコでの長期培養が原因だとすれば、その根拠といいますか、論文や資料がほしいところです。 'Used Old flask adhesion detachment'などでキーワード検索しても該当する論文にはたどりつけませんでした。 細胞培養につき、どういったことに注意すればよいでしょうか？ またその原因に関して、フラスコがもっともlikelyなことでしょうか？

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