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(無題) 削除/引用 No.5039-4 - 2016/05/06 (金) 12:55:24 - MP こんなやり方もあります。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100005179 Max以外の酵素も使えるのかはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.5039-3 - 2016/05/06 (金) 10:55:42 - AP 市販のキットなどでは、PCRのあと一切、反応停止や精製を行わず、ligationしてしまうプロトコールもあるくらいで、かえって余計な精製処理にないほうがよかったりして。少なくともゲル切り出しの精製でカラムを使うのならフェノール抽出は不用です。 同じPCR産物で先輩は成功しあなたは全くコロニーがでないということですので、おおさんの指摘のとおり、切り出しのUV照射が過剰である可能性はおおいに考えられます。うまくいっていなくてもバックグラウンドとしてコロニーはあるていどでるものです。それがゼロになり得るのがUV照射です。

(無題) 削除/引用 No.5039-2 - 2016/05/05 (木) 23:42:53 - おお ゲルで抽出するなら、フェノクロはいらないようなきがするけど、、、 切り出すときUVが当たっているなら、なるべくダメージがないようにするといいかと思います。この 辺はいろいろと昔からここで議論があります。銀紙でカバーしてレーンの端だけ当ててバンドを検出するとか。 ゲルから回収したときの収量は測っていますか？正確にはかれていますか、なにか持ち込みはないですか？ 鋳型の持ち込みは気にしなくていいのかな、、、

PCR産物のセルフライゲーション 削除/引用 No.5039-1 - 2016/05/05 (木) 23:16:27 - あべかわ ある遺伝子をコードするベクター(pEGFP-C1由来)に変異導入を行うため、変異を導入するプライマーを設計し、このベクターを鋳型として逆向きにPCRを行い、直鎖状DNAを増幅しました。プライマーの５'末端はリン酸化してあります。 PCR産物をフェノクロ抽出後、エタ沈し、アガロースゲルで目的のサイズのバンド(12kb)を切り出した後、カラムによってゲルを精製しました。 さらにこの精製したDNAをフェノクロ抽出、エタ沈してセルフライゲーションさせ、プラスミドを作出したいのですが、何度行ってもノーコロニーの状態が続いています。 私が増幅させたPCR産物を先輩に渡し、同じプロトコルで実施してもらうときちんとコロニーができます。 ライゲーションはTAKARA Ligation kitを使用し、16℃で６〜16時間反応させています。 先輩にアドバイスしてもらった点を気を付けても上手くいきません。どこを改善したらいいのかわからず困っています。 何かアドバイス等あればご教授お願いします。

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