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(無題) 削除/引用 No.5023-4 - 2016/04/27 (水) 12:05:35 - おお NHS-LC-biotinはLysineがターゲットなのでPoly-L-arginineにしてみればどうかとおもいました。それかビオチンのターゲットのアミノ酸を変えるか。 https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-labeling-crosslinking/protein-labeling/biotinylation.html コートしてから、ラベルの効率はどうなりましたか？全体的にあまり変わってないようだったらもしかしてコートとかより他の要因かもしれません。培地の成分が洗ったつもりでも残ったものが多くてその量によってラベルの効率が変わるとか。

(無題) 削除/引用 No.5023-3 - 2016/04/27 (水) 11:45:51 - e 返信有り難うございます。 NHS-LC-biotin使用で、接着細胞をビオチン化後、クエンチング、 cell lysisし、タンパク質濃度を揃えた後、アビジンビーズでON pulldown、 ビーズをwashしてsample bufferでboilという流れで行っています。 実は、細胞の剥がれが気になると思いつつ行った試験で サンプル間のぶれがひどく、PLLの使用を検討しました。 その後、実際PLL coatからのビオチン化を行っています。 細胞接着に関しては劇的に改善しました。 しかし、サンプル間のぶれは改善せず、（というかひどくなり） とりあえずPLLの使用は正しかったのか、、という点が気になり質問した次第です。 状況としては、半年ほど前うまくいっていたものが、うまくいかなくなっており、 変わった点は、 ・サンプル数が３−４倍に増え、作業時間がのびたので、はがれやすい ・6well→12well plateに変更 ・ビオチン濃度は節約のため1→0.5mg/mlに変えた ・PLLでコートした（細胞接着に問題ありとわかった後） アビジンで落とす前のlysateは揃っているので、問題はビオチン化かと思っていますが、、 すみません。 PLLからだいぶ論点がずれてしまいましたが、、、

(無題) 削除/引用 No.5023-2 - 2016/04/27 (水) 11:22:31 - おお なんか同じような質問があったような。ビオチンラベルの試薬とプロトコールを簡単に書いたほうがいいのでは？ 神経だとたまにPoly-L-arginine でコートしたりするのはみるけど。

biotinとPLLコートの組み合わせ 削除/引用 No.5023-1 - 2016/04/27 (水) 10:44:45 - e ビオチンで細胞表面を標識し、その後細胞をLysisして アビジンビーズで落とすという実験をしているのですが、 細胞が剥がれてしまうことがあります。 PLLなどでdishをコートすれば、細胞接着は良くなると思うのですが、 PLLはビオチン化に影響するのでしょうか？(lysine系のポリマーだと思うのですが・・）

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