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(無題) 削除/引用 No.5003-8 - 2016/04/20 (水) 11:03:09 - おお 2種類の酵素を入れるということはスター活性の原因となるグリセロールもばいになるわけで。。。

(無題) 削除/引用 No.5003-7 - 2016/04/20 (水) 10:58:32 - v 確かに何かThermoのまわしものみたいになっちゃってましたね。でも、Takaraや他社を悪く言うわけじゃないですが、本当にダイ入りのユニバーサルバッファーは便利ですよ。チャンスがあったらぜひぜひ試していただきたい限りです。 スター活性が完全にない、は確かに言い過ぎかもしれませんが、少なくとも今のところ問題になったことやスメアになったことはないので大丈夫かと思うのですが、断言は出来かねるポイントですね（ただ、シングルカットでシングルバンドになっているので、やはりスター活性の問題ではなさそうな気はしちゃいます）。 反応系については一応自分で普段行っているのを示して、実際混ぜている所までは見ていませんが同じように行っている感じです。 うーん、なぜでしょうね…？これといって落とし穴になりそうなところはなさそうなのでシークエンスを読んでみる他なさそうですね。T7 terminatorから読んで、一発ではっきりすればいいのですが…。

(無題) 削除/引用 No.5003-6 - 2016/04/20 (水) 10:34:52 - rec なるほど、Therm○のまわしものでしたか。 ちなみに、私はN○BのCutSm○rt派です。 FastDigestでスター活性がでないのは、短時間で酵素濃度を規定量入れていることが前提になっています。その条件でも十分切断できるからスター活性は気にしなくていいよ、ということだと思います。 今回、実際に実験を行ったのは新しく移ってきた学生ということですが、その方が以前行っていた自分のレシピに従って調製したために酵素を入れすぎたり、反応時間が長過ぎたりということはありませんか？ いずれにしても、シークエンスを読めば問題あるかわかるのですけど、原因がわかるとよいですね。

(無題) 削除/引用 No.5003-5 - 2016/04/20 (水) 10:10:44 - おお https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases/hf-nicking-master-mix-time-saver-other/high-fidelity-restriction-enzymes/high-fidelity-restriction-endonucleases

(無題) 削除/引用 No.5003-4 - 2016/04/20 (水) 09:52:04 - おお よくわからんけど、 FastDigestでスター活性がでないって過信ってことはないか、、、

(無題) 削除/引用 No.5003-3 - 2016/04/20 (水) 08:33:16 - v recさん ありがとうございます。あ、言い忘れていました、シングルカットでシングルバンドになることは確認済みです。 制限酵素処理無しでは、こちらはミニプレップしたものを用いた結果ですが、よくあるサーキュラーのパターンになっており、問題ないと思います。 酵素は全く問題無しです。ThermoのFastDigestを使っているため、スター活性やバッファーの取り違えでうんぬんもほぼ完全にないかと思います。 （関係無いですが、FastDigestは素晴らしいですよね。全ての酵素が同じバッファー・同じ温度、さらにゲルロード用にダイの入ったバッファーまで付けてくれる細やかな心配り、しかもめっちゃよく切れるしスター活性もない、それでいて価格も安い（これは場所によるかもしれませんが）という感じで、今まで使ってきた試薬の中でもっとも革新的だと感じしました。以前はTakaraの信者でしたが、これを使って以来、世界中のラボがFastDigestを使うようになればいいのに、と願わずにはおれません） …と、関係無い話をしてしまいましたが、何か他にもご意見ある方いらっしゃったらご提供いただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.5003-2 - 2016/04/20 (水) 08:15:19 - rec 1つの酵素だけで切断した時、1本のバンドだけなのを確認できましたか？ 怪しいのはスター活性 あと、市販品でも保存状態が悪いとおかしくなっていることもあるので、制限酵素処理しないで流してみるとよいかも

市販のベクターが制限酵素マップ通りに切れない 削除/引用 No.5003-1 - 2016/04/20 (水) 07:53:41 - v 市販品のチューブからおろしたpRSFDuet-1をEcoRI-HindIIIで切断してゲルでチェックした所、理論上30 bpの断片が得られるはずなんですが、600 bp程の断片が得られてしまいました。 長い方の断片は（ややマーカーが詰まり気味で判別が難しいですが）大体3 kbpぐらいで、足した長さは本来のベクターの長さに一致するように思われます。 実は自分ではなく別の学生（実験の経験はあるものの、入ってきたばかりの院生）がやっている実験なので、作業の一挙手一投足全てまでは把握していないのですが、どのステップも本質的な点においては概ね問題はないと思います。 こうなる理由として、何か考えられることはありますでしょうか…？ とりあえずシークエンスをしてみようと思いますが、何かありがち・見過ごしがちなポイントがありましたらアドバイスいただけると幸いです。

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