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(無題) 削除/引用 No.4996-9 - 2016/05/24 (火) 20:19:23 - もも シングルコロニー化はすでに回答されていますが そもそも効率が悪そうなのでアドバイスすると 鋳型のプラスミドをかなり希釈して使うとDnp1処理せずとも陽性のものが得られると思います おそらく0.1 ng/ 10 uL ぐらいでもPCRがかかると思います ご自身でPCRで増幅可能な鋳型濃度の下限を調べてみると良いでしょう

(無題) 削除/引用 No.4996-8 - 2016/04/18 (月) 17:10:27 - さく 中年様 そうかもしれません。シーケンス結果でこれは使えないと判断したので、プラスミドそのものを泳動した記憶がありません。塩化セシウムの密度勾配遠心なんかで頑張れば取れたのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.4996-7 - 2016/04/18 (月) 13:52:25 - 中年 さくさんの場合はプラスミドがダイマーになっていたということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.4996-6 - 2016/04/18 (月) 13:03:12 - おお ポイントミューテーションだけでほとんど一緒のプラスミドだと、プラスミド同士のコンペティションがかからないかもしれませんね。なので大腸菌に共存という可能性はあるのかもしれません。 ただし、理想的にはミューテーションが入ってないプラスミドは取れない仕組みになっているので、そのあたりを慎重にやればかなり改善はされるような気がしますよ。

(無題) 削除/引用 No.4996-5 - 2016/04/18 (月) 09:47:20 - さく 同じような事案で、得られたコロニーからシングルコロニー→シングルコロニー→シーケンスを実施しても、複数のコロニーを解析して得られた結果は全部プラスミド2種類が入っているという結果だったことがあります。 シングルコロニーアイソレーションを2回繰り返すぐらいじゃダメなのかもしれませんし、上手く変異が入った方は大腸菌に悪影響があって取れにくかったのかもしれません。 もっと何回もシングルコロニーアイソレーションを繰り返したら取れたかもしれませんが、私は結局最初からやり直しました。まれに菌種を変えると上手く行くことがあり、理由は不明ですがクローニングは取ってナンボなので、DH5αでダメなら試しにJM109とかBL21とかでやってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4996-4 - 2016/04/17 (日) 11:11:52 - quik 結構QUikChangeは効率よいし、何度もやってみてうまくいっていないということから、変異を導入したタンパク質が大腸菌に毒性がある可能性はないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4996-3 - 2016/04/17 (日) 07:58:25 - 中年 プラスミドの不和合性とは、「形質転換された大腸菌は、たった一つのプラスミドしか"安定的には"保持できない」ということであって、一過的に複数のプラスミドが共存し得ることとは関係ありません。 複数のプラスミドで形質転換された場合には、その大腸菌のsingle cellがコロニーにまで増殖する過程で、不和合性によってコロニー内の個々の菌はいずれか一方のプラスミドを保持するようになりますが、コロニー全体としては２種類のプラスミドをそれぞれ保持した菌が混在している訳です。 求めるクローンを得るためには、おおさんの仰るように、１）そのコロニーからsingle colony isolationをする、２）混合物のプラスミドを十分に希釈して再度形質転換をする、のいずれかの方法によります。

(無題) 削除/引用 No.4996-2 - 2016/04/17 (日) 02:52:55 - おお 大腸菌に両方入っている可能性はあります。特にトランスフェクションしてから早い時期は。増殖に伴って片方が脱落して均一になっていくので、結局一つしか入らないように見えます。なので賢い方法は形質転換でつかうDNA量はだいたい大腸菌一個に一つぐらい入る状況に近づけることです。多く使うと不要なものがプラスミド複製に有利だったばあい、目的のものもはいっていても、脱落していってしまいます。 コロニーPCRは色々とバックグランドなど拾う可能性があるので、その混在するやつはプラスミドを精製してしまってはどうでしょうか。それでも混じっているなら、そのプラスミドをもう一度トランスフェクションする手もあります。そのコロニーからシングルコロニーをひろう手もありますが、なんかGGのほうが増殖に有利でまだ菌に混在する状況ならバランスが変わって姉妹そうな気がしますけど、、、まあでもどちらも一緒かもしれません。

大腸菌の形質転換について 削除/引用 No.4996-1 - 2016/04/17 (日) 02:38:32 - 大腸菌の形質転換について プラスミドの連続する２塩基の置換をしようとしています。 KitはQuickChange mutagenesis kitを購入し、プライマーはアジレントのサイトで設計しました。 プラスミドはpcDNA3.1+でインサートは600bpほどです。 GGをttにしたいのです。 Dpn1の処理後（1時間、37℃）、DH５αに形質転換すると、500個くらいのコロニーを得ました。 かなり多い印象です。（鋳型のプラスミドは誤って500ngと推奨のやや多めを使っています。） Dpn1の処理が不完全なのか、鋳型がサーマルサイクラーで増幅されてしまったのかはわかりませんが、そのうち6つのコロニーをミニプレップ、配列解析しました。 すると、5/6が、鋳型と同じGGでしたが、1/6が不思議なことにGGとttを両方均等に持つことがわかりました。 この解釈としては、最初に拾った大腸菌コロニーが単クローンではなく、複数のコロニーだったという可能性を考えていますが（コンピテントセルはたった一つのプラスミドしか保持できないという記憶に基づいて）、この場合はそのクローンと思われていた大腸菌クローンを希釈して再度薄くプレートしてコロニーのピッキングをしたらレスキューできますでしょうか？ あるいはこの可能性の限りではないですか？例えばコンピテントセルが２種のプラスミドを同時に保持、増幅してしまう、などありえますでしょうか？ 実はこの変異導入には何度かトライしておりまして、これまで陽性のコロニーを得ることができておりませんでした。この度、コンタミの可能性はあるにしろ、right colonyが得られる可能性があるのでは？と期待しております。どうか経験豊かな皆様からのご意見、ご批判も含めまして、コメントをいただけますと幸いに存じます。どうぞ、宜しくお願い致します。

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