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(無題) 削除/引用 No.4973-9 - 2016/04/07 (木) 07:28:32 - おお たていすさんの指摘の件私も最初に気になってたんですが、こればかりはどんなデーターがあってそのように結論づけたのかわからないとなんともいいようがないわけですが、、、 でも流石にその解釈が違っていたらもしかしたら６xHisを除いても活性は得られないかもしれないという不安があるので６xHisの外し方だけ話ししていてもいいのかなぁとちょっと思ったりもします。まあたしかにこういう場だし、一緒に研究しているわけでもないのでそんな突っ込んだことが議論するのは現実的ではないかもしれませんけど。 活性中心に金属が配位していて奪われちゃうんでしょうかね、、、それだったらその金属を過剰に入れるとか、、、 色々空想はできますが、この部分は質問者に任せるしかないかなぁっと。

(無題) 削除/引用 No.4973-8 - 2016/04/06 (水) 23:28:43 - たていす ＞私の扱っている酵素は活性中心にHisがあり、タグの影響で失活する タグの影響で失活するというのはどういうふうに考えているのでしょうか？ その酵素は金属酵素ということですか？そうであれば、金属をNiから元の金属に置き換えるだけで、活性が回復したりしないかなあ？ まあ、そんなに単純じゃないかな。

(無題) 削除/引用 No.4973-7 - 2016/04/06 (水) 21:45:03 - おお pETのHisがN末に入っているタイプだと開始コドンに制限酵素NcoIがかぶっていたと思います。その下流にあなたの蛋白の開始コドンのメチオニンがあるかもしれませんが、それがNcoIで切れるならN末のタグを切り出せます。ただしほかにNcoIサイトが有る場合は少し工夫が必要です。 開始コドンより下流にフレームが一致してNcoIがある場合は、削れても酵素活性が維持されるならそれも選択肢の中にはいるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4973-6 - 2016/04/06 (水) 20:43:12 - entero > GSTやV5を切断できるプロテアーゼというものがあるんですね。 ないよ

(無題) 削除/引用 No.4973-5 - 2016/04/06 (水) 20:39:57 - 横 > GSTを除くときにアミノ酸配列依存的プロテアーゼを使います > 最初から特定のプロテアーゼ(Factor Xa, thrombin, V5など）で切れるような配列 GSTやV5を切断できるプロテアーゼというものがあるんですね。

(無題) 削除/引用 No.4973-4 - 2016/04/06 (水) 18:45:05 - おお ざっくり過ぎてよくわかりません。今手元にHisTag付きのあなたの目的の遺伝子を入れたプラスミドがあるのですか？それならそのプラスミドのバックボーンの名前はなんですか。 もしこれから作ろうとするのならGSTで精製後GSTが除けるタイプのものを使えばどうでしょうか。ただ、GSTを除くときにアミノ酸配列依存的プロテアーゼを使いますが、同じ配列があなたの酵素内にありますとあなたの酵素も切断されてしまう可能性がありますので配列を一度確認してください。

(無題) 削除/引用 No.4973-3 - 2016/04/06 (水) 16:22:13 - AP >タグだけピンポイントに外すことはできるのでしょうか？ そりゃ設計に拠るわな。 どういうベクターでどういうデザインで融合タンパク質にしてあるのか（するつもりだったのか）？ 発現・精製後にタグを外す予定なら、最初から特定のプロテアーゼ(Factor Xa, thrombin, V5など）で切れるような配列をあらかじめ入れておく。 >そこで、タグを制限酵素で取り除けば良いだけの話なのでは 制限酵素というのが比喩でなく（特異的な配列のみ切断するプロテアーゼをrestriction proteaseなどどいうこともあるようですが）文字通りのもので、ベクターを改造することを言っているなら、問題がいくつかあります。 ベクターの段階でタグを除けば、とうぜんHis tagを利用した精製はできない。単に除くだけでなく別のタグを入れる必要が出てくる。 タグがN末端にある場合、翻訳開始はタグの配列から起こるように設計されているので、それを除いてしまったら、翻訳開始に必要な配列を入れてやらないとならない。 当然のことながら、適当な制限酵素認識配列が適当なところにあるとは限らない。

(無題) 削除/引用 No.4973-2 - 2016/04/06 (水) 16:18:49 - entero プラスミドによってはThrombinとかFactorXaとかプロテアーゼの認識配列ありますよね 自分の使っているプラスミドに無ければ移し替えるとか、GSTにしてしまうとか

Hisタグについて 削除/引用 No.4973-1 - 2016/04/06 (水) 15:54:46 - 橘 はじめまして。 酵素精製について初心者なため、精製法についてご助言頂ければと思い、トピックを作製致しました。 Hisタグにより酵素精製を行いたいと考えていたのですが、私の扱っている酵素は活性中心にHisがあり、タグの影響で失活するという情報を入手しました。（先行研究より） そこで、タグを制限酵素で取り除けば良いだけの話なのでは と考えたのですが、タグだけピンポイントに外すことはできるのでしょうか？ また、もしできるとして、そのような操作により何か活性に影響を及ぼすケースもあるのでしょうか？ ざっくりとした説明で申し訳ありませんが、何かアドバイスを頂けると幸いです。

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