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(無題) 削除/引用 No.4972-11 - 2016/04/08 (金) 08:06:48 - おお あ、フィードバックありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4972-10 - 2016/04/08 (金) 08:02:56 - おお 昔はPCRのアプリケーションもそんなに多彩ではなく、アクリルアミドで電気泳動したりしてRIで引っかかったバンドを抽出してきて、プラスミドにライゲーションするというのは結構やられていたのでピコグラムオーダーでもあれば、インサートのはいったものが取れることはとれるんだと思います。TAとか使わずブラントでやるか、リンカーライゲーションをかますかだと思います。要はバックグランドを下げるために完全に切れているとか、脱リン酸化だとかそういうのがしっかりしていればかなり微量でも働く系だとおもいます。 TAにすることにより確かにそういった昔のやり方よりうまく行けばかなり効率が上げられる可能性があると思いますが、まあ昔の実験系をみてきた者にとってはそれほど驚かないです。ただたまに気難しいDNAフラグメントがあったりしますので、万全な系を心がけておいたほうがいいのかなという気がします。 わたしはDNA量は電気泳動のバンドでだいたい見積もってます。かろうじて見えるぐらいで数ナノでそれだけあれば十分です。 バックグランドの出方からしてコンピはさほど悪くはないのではと思いますよ。１０＾７ぐらいはあるのでは？

(無題) 削除/引用 No.4972-9 - 2016/04/08 (金) 07:02:22 - t 別に特別な話でもない単なるクローニングの結果なので書くまでもないことではあるんですが、一応備忘録として結果アップデートしておきます。 2.5 ng/uLのベクターを1 uL用いたライゲーションの結果、インサート無しで10コロニー程度、インサートありで数百コロニーかそれ以上、数えるのも面倒くさいような、「よし、よく生えたけど多すぎはしないベストな感じだな」という結果になりました。 コンピは、正直大してクオリティの高くないしょぼいコンピテンシーのもので、さらにいうとインサートはゲル切り出し後ナノドロップで計ったらなんとマイナスの値をたたき出したものを4 uL使った（普段から特にサイズの小さいフラグメントではゲル抽出後にマイナスになることはよくあって、それでもライゲーションは上手く行くことがほとんどなので、もう無視しています。どこかナノドロップがおかしかったりするんですかね？）、という感じのあまりにも酷い劣悪な条件の系だったのですが、こんなのでも問題なく働いてくれる辺りさすがTAクローニングですね。 （ちなみに青白もEcoRV切断も今回はやりませんでした。コロニーPCRの結果は全てポジティブでした） そもそものベクターの希釈については、以上の結果から、ケチろうと思えばまだまだ希釈しても問題なさそうです。次回は希釈済みのベクターを0.5 uL使ってみようと思います（もうわざわざ結果のアップデートはしませんが…）。

(無題) 削除/引用 No.4972-8 - 2016/04/07 (木) 10:35:31 - t mmさん、APさん、おおさん、度々ありがとうございます。 circularうんぬんは、単に浅知恵で適当ぶっこいただけなので、なかったことにして下さい。 コロニーPCRはいい手ですね。しかし、実はインサートにM13Fwdをアダプターとしてくっつけているので、M13を使うのはちょっと厳しいか…と思ったけど、幸いにもT7とM13Revがはさみうちの形になっているのでいけそうですね。本当はベクター部とインサート部とでプライマーを配置したい所ですが、方向も分からないしそれは不可能なのでやむを得ないという感じですかね（大きさで判別がつくはずなのでよし、という感じでしょうか）。 EcoRVも素晴らしい妙手ですね。あまりにネガティブクローンが割合的に多かったら試してみようと思います。 瑣末な質問にお付き合いいただきどうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4972-7 - 2016/04/06 (水) 18:27:04 - おお >[Re:4] tさんは書きました : > > ついでなので追加で質問させていただきたいのですが、今回非常に小さい産物を扱うこともあるんですが、例えば100 bp程度の場合、フレームが偶然合ってしまったとして、青白セレクションで有意に色の違いは得られるものでしょうか？ 一応、フレームがあった場合青になる可能性があるとプロトコールなどに注釈があるものもみます。 > 真偽は定かではないですが、「製品には意図的に青くなるもの(circular?)が混入されている」と聞いたことがあり、実際常に一定割合で青コロニーが出現していた記憶があります。 すでに指摘がありますように、circularが入ってなくとも青が出現するであろう理屈が存在します。なのでわざわざ入れなくてもという気がします。 > そもそも青白セレクションはどうも信頼性に欠ける為最近はもっぱら使っていなかったんですが、TAクローニングでは特にあまり効率が良くない場合には上記の「意図的なネガティブクローン」を拾う確率が高くなってしまうことが予想されるので、せめて完全な青を避けるべく久々に青白をやった方がいいのかな、と思った次第です（もちろん十分なコロニー数が得られるように系を設計すべきなのが最重要なのはもっともなんですが）。 > インフレームでもlacZの活性を抑えられる最小のインサートってのはどの程度なんでしょうかね…？ まあTAでなくってブラントでセルフライゲーションがLacZポジティブになるというのは、スクリーニングとしてかなり有効です。でもTAのばあいはからはかなり低い頻度でしか出てこない仕組みになってますので、青白の選択がどこまで有効かと言われれば確かに有効とはっきり言えるほどでもないと思います。ただ大腸菌の中でライゲーションが起こったりというクローンの一部を無視できるという利点はありますけど。 効率が悪いときは、青白の判定をやってもやらなくても精製後外れだったという確率は高くなるだろうと思いますし、もしフレームがあって青になるおそれがあるなら、ベクターだけのライゲーションのコントロールを取ってライゲーションなどあなたの系がワークしているか見ながらクローンを拾う手もあります。 私はコントロールだけを先にトランスフォーメーションして、バックグランドが１０以下になる量でライゲーションをするようにすることがあります。１０よりはるかに多いクローンがでていればライゲーションされたものによるもので、１０以下でも目的のクローンが存在することがありますが、それぐらいの数ならミニプレップも負担になるほどの数ではないので。

(無題) 削除/引用 No.4972-6 - 2016/04/06 (水) 15:40:31 - AP >> 真偽は定かではないですが、「製品には意図的に青くなるもの(circular?)が混入されている」と聞いたことがあり、実際常に一定割合で青コロニーが出現していた記憶があります。 市販TAベクターに限らず新しいベクターは、一度はside-by-sideで、ベクターのみligation無し、インサート無しligation有りのコントロール実験を入れて、バックグラウンドがどれくらいあるか見ておくべきですね。 意図的にそうしたわけではなくても、市販ベクターであろうとある程度のバックグラウンド（脱リン酸化やdT付加が100%ではないことによるセルフライゲーションあるいは切れ残りなどで生じるnonrecombinant)は必ずあるといってよくて、メーカーも100%を保証しているわけではないです。 pGEM-TでインサートにEcoRVがないなら、ligation産物をEcoRV処理する手もあります。

(無題) 削除/引用 No.4972-5 - 2016/04/06 (水) 13:07:52 - mm >[Re:4] tさんは書きました : > ついでなので追加で質問させていただきたいのですが、今回非常に小さい産物を扱うこともあるんですが、例えば100 bp程度の場合、フレームが偶然合ってしまったとして、青白セレクションで有意に色の違いは得られるものでしょうか？ フレームが合っていれば青コロニーになる可能性は高いでしょうね > 真偽は定かではないですが、「製品には意図的に青くなるもの(circular?)が混入されている」と聞いたことがあり、実際常に一定割合で青コロニーが出現していた記憶があります。 初耳です 実際青コロニーのシークエンスみたことありますけど、末端が削れたセルフライゲーションでは？ M13プライマーでコロニーPCRすれば100bpくらいなら区別はつきます

(無題) 削除/引用 No.4972-4 - 2016/04/06 (水) 12:37:25 - t APさん、おおさん、コメントどうもありがとうございます。 言われてみれば全くもってその通りですね。当時から今に至るまで物事を深く考えず機械的に作業していたのが丸分かりでお恥ずかしい限りです。 調べてみたら製品は50 ng/uLのようで、記憶にある”x1/20を1 uL”は、十分妥当な量ですね。 ついでなので追加で質問させていただきたいのですが、今回非常に小さい産物を扱うこともあるんですが、例えば100 bp程度の場合、フレームが偶然合ってしまったとして、青白セレクションで有意に色の違いは得られるものでしょうか？ 真偽は定かではないですが、「製品には意図的に青くなるもの(circular?)が混入されている」と聞いたことがあり、実際常に一定割合で青コロニーが出現していた記憶があります。 そもそも青白セレクションはどうも信頼性に欠ける為最近はもっぱら使っていなかったんですが、TAクローニングでは特にあまり効率が良くない場合には上記の「意図的なネガティブクローン」を拾う確率が高くなってしまうことが予想されるので、せめて完全な青を避けるべく久々に青白をやった方がいいのかな、と思った次第です（もちろん十分なコロニー数が得られるように系を設計すべきなのが最重要なのはもっともなんですが）。 インフレームでもlacZの活性を抑えられる最小のインサートってのはどの程度なんでしょうかね…？ なんか無駄に長くて下手な説明でどうもすみません。アドバイスいただける方いらっしゃいましたら幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4972-3 - 2016/04/06 (水) 11:00:05 - おお 数字的にはAPさんのとおりだと思います。おそらく一回数十ngだと思いますが、かんたんに入る場合は1/5-1/10の量で十分だとおもいます。T/Aではないですが、通常のコンストラクションで私はバックグランドを下げるために更にそれ以下の濃度でやることもあります。注意が必要なのはコンピテントの効率が良いことが前提です。

(無題) 削除/引用 No.4972-2 - 2016/04/06 (水) 10:51:00 - AP 希釈率でベクター量を決めたことなんてないんですけど、 ベクターそのものの量で10 ngオーダーあれば十分、なんなら数ngでもできます。 だって、おそらく単一種のPCR産物をクローニングした一個のクローンが得られればいいだけでしょう？ 10 ngベクターをligationしてcompetentな産物がたった0.01%しかできなかったとしても1 pg、それだけあれば10^7 cfu/ugベクターのcompetent cellsを形質転換すれば数十クローン得られます。

TAクローニング（pGEM-Tベクター）の希釈 削除/引用 No.4972-1 - 2016/04/06 (水) 10:12:38 - t ものすごく久しぶりにTAクローニングをする予定なんですが、すっかり昔のことでどのぐらいまでベクターを薄められるかをすっかり失念してしまいました（x1/20を1 uLとかそんなもんだったかなぁ…？）。 もちろんインサートの長さや量にもよると思いますが、どの程度まで希釈しても問題なく使えるかについて、情報提供いただけたら大変幸いです。

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