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(無題) 削除/引用 No.4966-15 - 2016/04/07 (木) 01:49:12 - １２３４５６７８９ 膜は何よ？

(無題) 削除/引用 No.4966-14 - 2016/04/05 (火) 22:28:47 - おお 更に余談ですが、やはり５kDとかその辺の領域のものは通り抜けてしまう可能性を考えて条件を慎重に決めることも結構あるようです。

(無題) 削除/引用 No.4966-13 - 2016/04/05 (火) 14:25:46 - EN いろいろなアドバイスをいただきありがとうございました。 メンブレンの1枚目（ゲルと接していた方）と2枚目（さらに重ねた方）を抗体反応させてバンドを確認してみたところ、転写45分では、2枚目のメンブレンにバンドは検出されませんでした。ちなみに、前回の検討（転写60分）では、2枚目のメンブレンにも極々わずかにバンドらしきものが見えたように感じました（高感度で検出し、バックも濃くなっているので明瞭ではありませんが）。 今回の実験に関しては、転写60分では通り抜けの懸念が若干あるが、転写45分ではおそらく大丈夫、マーカーは転写45分でも通り抜け（色移り？）があるが、目的タンパクに関しては問題なさそう、と結論づけることにしました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4966-12 - 2016/04/05 (火) 08:28:19 - 中年 通り抜けはありますよ。もちろん条件によりけりですが。転写効率の確認にCBBやポンソーで膜を染めていたことがあって、大きいタンパク質が写りにくいのは当然として、小さい領域も明らかに薄くなっているパターンはよく見ました。大きいタンパク質を写りやすくするためにトランスファーバッファーに薄いSDSを入れるプロトコルなんかでは、下の方がほとんど真っ白でびっくりしたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.4966-11 - 2016/04/05 (火) 05:30:22 - おお 余談ですが、確かニトロセルロースをつかって、一枚のゲルから１０枚重ねて、１０枚の膜にトランスファーできるというのが商品化されていたのを大昔みました。条件をコントロールすることで抜けやすくもなるかなと。まあPVDFは吸着力が強いのでそうかんたんに抜けないかなぁという気がしますけど。

(無題) 削除/引用 No.4966-10 - 2016/04/05 (火) 03:57:24 - ポンソー >マーカーは写りやすいということがあるのでしょうか？ ありますよ。　私がウェット式で4度O/N転写をしているのを見たボスが、それだとタンパクが抜けたりしないか？一度メンブレン二枚重ねでやってみろ、というので試したことがあります。 結果、二枚目のメンブレンは、ポンソーで全然染まらなかったけれど、マーカーは綺麗に色がついていました。 自分が見ていたのは80kDaと38kDa程度の大きさのタンパクでしたが、これも抗体でバンドが検出できるかどうか二枚目のメンブレンで試してみたところ全くバンドは見られませんでした（超高感度のECLとかなら別なのかもしれませんが、普通ECLでは全然見られなかった）。もちろん、一枚目のメンブレンでは普通ECLでくっきりバンドが出ました。 以来、自分はタンパクが抜けるというのは都市伝説なんじゃないかと思ってます。転写を長くやりすぎて（ついよくやってしまう）バンドが薄くなってしまった、という経験も自分はしていないですし。 まあ、心配なら一度試してみては？既に指摘があるように、別のタンパクでは話が変わるかもしれませんから。

(無題) 削除/引用 No.4966-9 - 2016/04/05 (火) 03:16:48 - しろ 1枚目と重ねた2枚目を同じように抗体反応させてバンドがどう出るか比較すればいいだけではないでしょうか。当方も以前試したことがありますが、2枚目には全くバンドがでなかったのでそれ以降転写時の通り抜けはほぼ考えないようにしています。

(無題) 削除/引用 No.4966-8 - 2016/04/05 (火) 03:05:48 - おお ５０kDaぐらいならあまり気にせず標準に近い方法でやってます。Tris-Glycine pH8.3, 20%methanolで７５ー９０minです。バッファーにはSDSははいっていません。高分子がわがトランスファーされないとそれも問題なので、全体のバランスで小さいものが少し抜けるのは仕方がないこともあるでしょう。ただ５０kDaが小さいとはあまり思っていません。 どうしてもという場合は、ちょっと密なメンブレン（ポアサイズ0.2umとか）、げるをグラジエントにするとかの工夫で改善できるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4966-7 - 2016/04/04 (月) 15:06:15 - 中年 通り抜けやすさにはタンパク質ごとの個性もあるので、ご覧になりたいタンパク質が効率よく転写されていて通り抜けが起こっていないということの検証は別に行う必要があるかもしれませんが、全体としての傾向をみるために、まずはその２枚のメンブレンをCBBなど全タンパク質を染め出す試薬で染めてみて、お使いの転写条件で分子量のどのレンジが適切に転写されているかを確認してはいかがですか。

(無題) 削除/引用 No.4966-6 - 2016/04/04 (月) 14:41:35 - EN すみません。訂正させていただきます。 （処理中のメンブレンを再度見て確認しました。） バイオラッドのPrecisionマーカーで、37, 50, 75, 100, 150, 250kDのバンドがゲル上にある状態で、2枚目のメンブレンに転写されていたのは、特に、50, 100, 150kDのバンドでした。中でも、50kDは濃く転写されています。50kDは元々マーカーの中でも濃いバンドとなるようです。そして、転写されていない75kDはピンク色、他のバンドは青色です。37, 250kDのバンドも非常に薄くですふが転写されていました。 大きいサイズのバンドも2枚目に転写されているので、マーカーが通り抜けやすいということなのでしょうか？ 転写条件は、セミドライ式でPVDF膜に45分転写しています。転写バッファーにはTrisとメタノールが含まれています。

(無題) 削除/引用 No.4966-5 - 2016/04/04 (月) 14:23:42 - EN おおさん コメントありがとうございます。 バイオラッドのPrecision、まさにそれを使っています。 2枚目のメンブレンも抗体反応させて見てみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4966-4 - 2016/04/04 (月) 14:21:11 - EN さっそくコメントをありがとうございます。 見ようとしているタンパク質の分子量は60kD前後なので、SDS-PAGEの時点で低分子量のものは流しきり、マーカーも50kDより上のバンドが残っている状態なのですが、転写すると50kDのバンドがうっすら写っていました。なので、「低分子量のマーカーほど転写されている」のですが、50kDほどのサイズでも、通り抜けしうるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4966-3 - 2016/04/04 (月) 14:18:45 - おお 個人的な感想ですがバイオラッドのPrecisionはゲルから抜けやすい印象があるので、まくの裏側に出てくるのも速いかもしれません。ただし個人的な感覚なので、科学的ではありません。 低分子といってもどれくらいのレンジの蛋白をいっているのか、トランスファーのコンディションはどうなのか示していただかないとあまり具体的なことが言いにくいです。 とにかくはその二枚目のメンブレンを１枚目とSide by sideでWBしてみたらどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4966-2 - 2016/04/04 (月) 14:11:28 - うんと 低分子量のマーカーほど転写されてはいませんか？

ウエスタンブロット転写時のタンパク通り抜け 削除/引用 No.4966-1 - 2016/04/04 (月) 14:08:13 - EN ウェスタンブロットで、転写時間を長くしすぎると低分子量のタンパク質が通り抜けることを知り、転写時間を検討しています。通り抜け確認用にメンブレンを2枚重ねて転写してみたところ、2枚目（ゲルに接していない方）のメンブレンにマーカーがうっすら写っているのが目視で確認できました。この時点で、通り抜けしているということなのでしょうか？それとも、マーカーは写りやすいということがあるのでしょうか？

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