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(無題) 削除/引用 No.4952-7 - 2016/03/28 (月) 12:52:06 - え 同じ日に染色しないといけない理由ってなんだろう？

(無題) 削除/引用 No.4952-6 - 2016/03/28 (月) 12:35:10 - おお ＞分化誘導開始後、day 0, 5, 10, 15のタイムポイントでオイルレッド O 染色したいです。 これが実験で必要な条件と考えられるならば、分化誘導時に同じ条件でないと結果を比べられないのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4952-5 - 2016/03/28 (月) 10:32:32 - 脂肪いや monさん、ありがとうございます。 ご指摘いただき、ありがとうございます。 誘導薬剤に関してはルーチンに間葉系幹細胞からの分化に用いているものです。ただ、3T3L1では初めてで、これらの試薬で問題ないかどうかは（論文ではこれで正しいです。）未検討です。 > もし予備的検討（初めての実験）なら、面倒でも欠点が少ない、「同じ日にセットアップし同様に操作して、各日でオイルレッドO染色」が真っ当だと思いますよ。 3T3-L1のレギューラー培地での増殖が比較的早く、10日レギュラー培地で培養後、誘導試薬をかけるとなると、10日間で細胞密度や細胞数は変わってしまうし、オーバーグロースになってしまうんです。最初にまく細胞数を影響がないくらいにまで減らすのも手ですが、下のみさんも仰られるように、コンフレントになってから分化誘導を開始するのがプロトコルとして成立しているようなんです。狭間で葛藤しています。 ですが、monさんにご指摘いただいたように、まずはコンフレントになったら誘導試薬を加えて、10日後にきちんと脂肪細胞が分化誘導されているかどうかをまずは確認することにします。その後、どうやってタイムコースを取るかを考えて行くべきですね。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4952-4 - 2016/03/28 (月) 10:23:14 - mon 前者も後者もそれぞれ欠点がありそれは理解しているとは思いますので、何を観たいか（調べたいか）によるでしょう。 勝手な思い込みかもしれませんが、予備的検討も済ませていないで、本実験（例えば薬剤添加の影響調査？）を組もうとしているように思われます。 もし予備的検討（初めての実験）なら、面倒でも欠点が少ない、「同じ日にセットアップし同様に操作して、各日でオイルレッドO染色」が真っ当だと思いますよ。これが再現良く出来るようになってから、前者あるいは後者を行って実験結果が問題なければ本実験でそれを採用すればよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4952-3 - 2016/03/28 (月) 10:12:49 - 脂肪いや みさん、ありがとうございます。 ということは、分化誘導を開始すると増殖は止まるという理解でいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4952-2 - 2016/03/28 (月) 09:26:55 - み regular mediumでコンフルエントになるまで培養し、さらにコンフルエント後も何日か培養した後、分化培地に換えないと効率よく分化はしなかったような。

3T3-L1で脂肪細胞分化の経過実験の組み立て方 削除/引用 No.4952-1 - 2016/03/26 (土) 15:25:04 - 脂肪いや いつもは勉強させてもらっています。 3T3-L1細胞を脂肪細胞へと分化誘導させる際の実験の組み方について困っています。 ww.abcam.co.jp/protocols/differentiation-of-3t3-l1-cells-into-adipocyte-like-cells-protocol 3T3-L1をadipogenic mediumで飼うと10日ほどで脂肪細胞様になります。 分化誘導開始後、day 0, 5, 10, 15のタイムポイントでオイルレッド O 染色したいです。 理想的にはday 15ですべての時間のサンプルを一度に染めればいいなと思っていますが、実験の組み立て方として懸念している点があります。 1. 4つのwellに細胞をday 0にまく。 2. day 1でadipogenic mediumを4つのうちの1つに加える。(For day 15) 3. day 6でadipogenic mediumを残り3つのうちの1つに加える。(For day 10) 4. day 11でadipogenic mediumを残り2つのうちの1つに加える。(For day 5) 5. day 16で細胞をオイルレッドO染色を行う。 ただこの方法だと、regular培地で飼っている間、細胞がコンフレントになってしまって細胞が死んでしまうのではと思っています。 そこで、次の方法がいいのではないか？と思っていますが、実際どうでしょうか？ 1. 4つのwellのうち、１つに細胞をday 0にまく。 2. day 1でadipogenic mediumを加える。(For day 15) 3. day 5に、残り3つのwellのうち、１つに細胞をまく。 4. day 6でadipogenic mediumを加える。(For day 10) 5. day 10に、残り3つのwellのうち、１つに細胞をまく。 6. day 11でadipogenic mediumを加える。(For day 5) 7. day 16で細胞をオイルレッドO染色を行う。 後者の方が手間はかかりますが、実際こちらの方がいいのではないか？と思っていますがどうでしょうか？3T3-L1の細胞増殖が、分化誘導時に停止もしくはゆるやかになることが前提にはなりますが。 お手隙の際にご意見をいただけると大変嬉しく思います。

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