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(無題) 削除/引用 No.4935-6 - 2016/03/25 (金) 18:36:32 - asan そういったケースもあり得ると思いますけど、Creの飛び効率が悪いとか、目的とした組織で何らかの理由で飛んでないという可能性だってあるので、取りあえずPCRとかでCreの飛び効率を確認すべきでしょう。 IHCできるのに、WB不可能ってそんなにあるんですかね？逆は多そうですが。最近は抗体作製も比較的安くなってるので、コンディショナルマウスを解析するぐらいの遺伝子ならば抗体の自作も考えた方が良いのでは？とは思ったりもします。 ちなみにデリーションになる事は十分にあり得るでしょうが、通常はデリーションになってもどこかしらSTOPが入るかどうかを確認したりしませんか？ATGの場所が確実で、オルタナティブATGとかがなければATGのあるexsonを飛ばせばいいでしょうが、機能ドメインが分かってればそのドメインを潰す方が確実な事もありますからね。 floxという事は過去にKOマウスがおなじ場所の欠損で作られてたりしてないですか？ ちなみに、抗体のバックグラウンドを拾ってるなんてことはなかったりしますかね？

(無題) 削除/引用 No.4935-5 - 2016/03/22 (火) 10:57:05 - Kitty >こういった可能性を限りなく排除するためには、 >ORF 全体を飛ばしたり ATG を含む領域を飛ばしたりする方がより安全です。 分生さんの仰る通りだと思います。 場合によっては、 アミノ末端のみの発現によるドミナントネガティブ効果も 考えないといけませんよね。

(無題) 削除/引用 No.4935-4 - 2016/03/20 (日) 16:10:14 - 分生 あるかないかという質問への答えなら「あります」。 多分 ATG は exon1 か2 にあるんですよね。3-4 を全部飛ばしても2 と5 が in-frame で繋がってstop コドンまでたどり着く場合、ご質問のような事は起きます。たとえ exon5 から読み枠がずれてデタラメなタンパクになったとしても　ex1,2 だけは見かけ上機能するタンパクであり、そこに重要な機能ドメインがある場合には機能的には殆んど影響を受けず、野生型っぽく振る舞う可能性は十二分にあります。 こういった可能性を限りなく排除するためには、 ORF 全体を飛ばしたり ATG を含む領域を飛ばしたりする方がより安全です。

(無題) 削除/引用 No.4935-3 - 2016/03/20 (日) 00:00:46 - おお Exon３、４を飛ばしたのはわかったんだけど、ATGはどこよ。 KKさんの指摘のように、もう少し確実にわかる方法論をとったほうがよろしいかと。

(無題) 削除/引用 No.4935-2 - 2016/03/19 (土) 16:01:48 - KK Creでコンディショナるに飛ばしているのかどうか分かりませんが、mRNAの発現が同等にみられている時点でまずその点をきちんと解析するべきでしょう。Creのシステムが動いてないことも良くありますし。 プライマーの設計を考えれば特定のどのような形でmRNAが出ているのかはすぐ分かりますし、どの程度の効率でCre依存的な欠損が起こっているのかも定量可能です。 その上でタンパクレベルでの発現を考えれば良いですが、そもそも欠損してない気がします。floxの作製時点で欠損後にフレームシフトが起こるように設計している事も多い気がしますし。

ノックアウトでも組織が抗体で染まる解釈 削除/引用 No.4935-1 - 2016/03/19 (土) 15:14:48 - ko 質問をさせてください。 エクソン3-4をfloxedで飛ばしたマウスがいます。そのマウスでIHCによりノックアウトを確認したいです。westernに使える抗体はないんです。qPCRによりmRNAの発現はノックアウトでも同等にされているようです。 IHCでN末を認識する抗体で染めてみるとノックアウトでも同じように染まりました。細胞質なのか特異的なオルガネラまでが染まっているのかまできちんと見ていませんが、この解釈として、N末を認識する抗体であればN末のみ存在するトランケートタンパク質を認識してしまっているという解釈をしています。 なので、ノックアウトマウスというのは機能的なタンパク質がなくなっているだけであって、トランケートなタンパク質はありえる、とかんがえてもいいのでしょうか？

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