全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.4919-20 - 2016/03/28 (月) 13:42:17 - PCR ねずみ様、重ねてお礼を申し上げます。何度も何度もコメントをいただき、有難うございます。 > 一方のarm配列を増幅する２つのプライマーの両方に変異を入れるものと勘違いしておりましたが、そうではないようですね。変異を導入する目的が、「targeting vector構築のため」、ではなく「ゲノムに変異を導入する」ということであれば、strategyを考えなおす必要があるでしょう。 はい。お察しの通りで、マウスゲノムに変異（一塩基置換）を導入することを目的にしています。Cre-LoxPシステムを利用しています。また、ホモロジーアームのクローニングの際にも3'のホモロジーアームのクローニングに必要な酵素の認識配列が5'ホモロジーアーム内にあってしまったので、5'ホモロジーアーム内に制限酵素認識配列を壊したものを作成しました。 結果として情報を小出しにしてしまい、大変申し訳ありません。 コンストラクションは以下の通りです。 Not1 - 5'homology arm (600 bp) - (selection cassette) - 3' homology arm (500 bp) - EcoRI です。 一塩基変異は、3' homology armの500 bpのうち、10塩基目の塩基が置換しています。 一方、制限酵素配列を壊す目的で導入した別の塩基変異は、5' homology armのうしろ550番目にあります。 実際にリコンビネートした細胞はcolony PCRの要領でスクリーニング予定です。 全く期待したものが取れないと考えたほうがいいでしょうか？それともスクリーニングで数をあげれば拾える可能性はありますでしょうか？ targeting vectorの両端（5' armの5'端と3' armの3'端）がhomologous recombinationの結果どのような挙動を示すか、を考えてみると良いでしょう。 確かに頻度としては少なそうです。ただ、selection casetteで少なくとも導入された細胞はできるはずなので、そこからcolony PCRで釣り上げられないかと考えていますが、先のコメントでいただいたように、たった一塩基の置換でもhomologous recombinationに影響を与えるとことについては全く予期していませんでした。非常にクリティカルなご指摘を前もっていただき、心から感謝しております。In fusionのことについて真剣に考えてみますが、現行の系が全くうまくいかないのかどうかは正直わかりません。一度挑戦する価値はありますでしょうか？一度やってみたいと思っています。どのくらいselection cassetteでスクリーニングされるか興味がありまして。

(無題) 削除/引用 No.4919-19 - 2016/03/28 (月) 13:29:13 - PCR PCRです。 まずは様、コメントをいただきまして、有難うございます。 制限酵素配列を外すことはできないんです。 ホモロジーアームは最低でも500 bpほどを用意したいと思っています。 > もしくは、ホーミングエンドヌクレアーゼを使うと認識配列はまず存在しないし、先にでているIn Fusion系なら変異を入れる必要はないですよね ホーミングヌクレアーゼというものもあるのですね。 In-Fusion、今回の場合に最適なようですね。実行可能かどうかについて上司と打ち合わせすることにします。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4919-18 - 2016/03/27 (日) 16:53:16 - ねずみ > というように、上記の配列がゲノムに組替えられますよね？つまり小文字のxやyは組替えから外れてしまうと考えるのが正解でしょうか？ 一方のarm配列を増幅する２つのプライマーの両方に変異を入れるものと勘違いしておりましたが、そうではないようですね。変異を導入する目的が、「targeting vector構築のため」、ではなく「ゲノムに変異を導入する」ということであれば、strategyを考えなおす必要があるでしょう。targeting vectorの両端（5' armの5'端と3' armの3'端）がhomologous recombinationの結果どのような挙動を示すか、を考えてみると良いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.4919-17 - 2016/03/25 (金) 12:22:06 - まずは 使いたい制限酵素の切断配列が末端にしかなくて、それを除いても十分な長さのホモロジーアームになりうるなら、最初から外してしまえばよいのでは もしくは、ホーミングエンドヌクレアーゼを使うと認識配列はまず存在しないし、先にでているIn Fusion系なら変異を入れる必要はないですよね

(無題) 削除/引用 No.4919-16 - 2016/03/23 (水) 13:27:31 - PCR seventh様、ねずみ様、 返信が大変遅れましたこと、誠に申し訳ありません。 ねずみ様からいただいたアドバイスをもとに今後改良する点が見つかりました。 現在までの進捗状況に関してです。 5'ホモロジーアームとして、600 bpほどあります。以下がその配列です。 5'- XXXXXXxXxXxXXXXXXXXX-600 bp-XXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3'（小文字のxはプライマーに変異を持たせたことによるsilent mutationだったりintron内の人工的な変異です。） 同様に、3'ホモロジーアームとして、500 bpほどあります。以下がその配列です。 5'- YYYYYYYYYYYYYYYYYYY-500 bp-YYYYYYYYYYYyYyYyYYY -3'（小文字のyはプライマーに変異を持たせたことによるsilent mutationだったりintron内の人工的な変異です。） これらを持つtargeting vectorで相同組替えを期待した場合、 5'- XXXXXXXXX-600 bp-XXXXXXXXXXXXXXXXXXX - (selection casette) - YYYYYYYYYYYYYYYYYYY-500 bp-YYYYYYYYYYY -3' というように、上記の配列がゲノムに組替えられますよね？つまり小文字のxやyは組替えから外れてしまうと考えるのが正解でしょうか？ 引き続きコメントをいただけますと幸いに存じます。自分も浅はかさを実感しておりますが、Biotechnical forumさんにて計画の確認を取らせていただけると大変嬉しく思います。どうか、宜しくお願い致します。 PCR

(無題) 削除/引用 No.4919-15 - 2016/03/17 (木) 23:56:20 - ねずみ > 実際にはいくつかsilect mutationを施しますが、例えば、GAA (グルタミン酸)をGAG(グルタミン酸)のようにsilect mutationにして、EcoR1 digestionに対して抵抗性を持たせるためなのですが、問題が生じますでしょうか？ homology armのcloningの際には極力mutationが入らないようにするのが鉄則です。2 kbのarm内に1塩基の変異が入っただけでも組み換え効率に影響が出ると言っている人もいます。PCRさんのstrategyではarmの両末端にmutationが複数入ることになるのでその領域はarmとしての役割を果たさない可能性が高いと思われます。それならわざわざmutationを入れるということをしなくても、その内側の領域をarmとして利用すればよいのではないでしょうか。ゲノム編集と組み合わせてのtargetingであれば500 bpのarmでも十分に機能する場合もありますので、面倒なことをするよりもそのほうが現実的だと私は思います。

(無題) 削除/引用 No.4919-14 - 2016/03/17 (木) 17:43:26 - seventh ゲノムとターゲットベクターの相同性が低下した場合でもノックアウトがうまく働くかどうかという問題ではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4919-13 - 2016/03/17 (木) 15:39:42 - PCR ねずみ様、おお様、 > クローニングのために利用したい制限酵素サイトを潰すことが目的と読み取れるのですが はい、その通りです。 > In-FusionやNEB Builderを利用することは出来ないでしょうか？ 大変お恥ずかしいですが、このテクノロジーを存じ上げませんでした。ご教示いただきありがとうございます。まずはこれらのことを勉強してみます。 > 人工遺伝子合成の受託サービスを利用するのも選択肢の一つだと思います。 数万円で可能なのですね。委託は考えてもいませんでしたので、費用対効果を比べてみます。 > 私の理解不足なのかもしれませんが、targeting vectorにsilent mutationを入れる、というのは考え方として大丈夫なのだろうかと感じますが。。 実際にはいくつかsilect mutationを施しますが、例えば、GAA (グルタミン酸)をGAG(グルタミン酸)のようにsilect mutationにして、EcoR1 digestionに対して抵抗性を持たせるためなのですが、問題が生じますでしょうか？ codon usase/frequencyが問題になるとおっしゃられておられますか？ 大変恐縮ですが、この考え方に問題がありましたら、どうかご教示いただけますと幸甚です。 重ねてお礼申し上げます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4919-12 - 2016/03/17 (木) 06:49:06 - おお >[Re:11] ねずみさんは書きました : > > 私の理解不足なのかもしれませんが、targeting vectorにsilent mutationを入れる、というのは考え方として大丈夫なのだろうかと感じますが。。 よんだときあまり考えてなかったんですが、確かになんだろうって感じですね。。。

(無題) 削除/引用 No.4919-11 - 2016/03/17 (木) 00:16:05 - ねずみ 人工遺伝子合成の受託サービスを利用するのも選択肢の一つだと思います。700 bp程度であれば3~4万円程度でしょうか。~2万円というところも見たことがあります。 クローニングのために利用したい制限酵素サイトを潰すことが目的と読み取れるのですが、In-FusionやNEB Builderを利用することは出来ないでしょうか？ 私の理解不足なのかもしれませんが、targeting vectorにsilent mutationを入れる、というのは考え方として大丈夫なのだろうかと感じますが。。

(無題) 削除/引用 No.4919-10 - 2016/03/16 (水) 23:17:50 - おお >[Re:8] PCRさんは書きました : > おお様、 > > その部位にsilent mutationを持たせることが目的なんです。 Got it. > > おお様ならquick change mutagenesisを何度か繰り返すことで目的のアンプリコンを得ますか？それとも・・・次に書かせていただきます。 わたしはたいていPCRで導入します。

(無題) 削除/引用 No.4919-9 - 2016/03/16 (水) 15:39:42 - PCR まずは様、重ねてお礼申し上げます。ありがとうございます。 Forward primer 5'- taataaGCGGCCGCxXxXXXXXXXXXXXXXXxXXxXXXXXXXXxXXxXXXX -3' Reverse primer 5'- tcctccGAATTCXxXxXXXXXXXXXXXXXXXXx -3' なるほど、アダプターなるものを合成して、それをライゲーションすればいいのですね。それでしたら複数の変異を持たせておいても容易にできそうですね。 > そのプライマーでもPCRはかかるでしょうけど、reverse primerの3'端はエクソヌクレアーゼ活性で高確率で除かれそうです ほんとそうですね・・非常に恥ずかしく恐縮です。 末端のミスマッチが除去されれば、それでもPCRはかかるでしょうが、のちにmutagenesisは必要になりそうですね。 > あと、TAベクターとかTOPOとかPCR産物をそのままベクターに入れるなら、遊びの配列はいりません 仰る通りです。今回はdirectにcloningするか、それともTOPOを介してクローニングするか決めあぐねておりましたので、念のため遊びの配列をつけたものを合成しました。 アダプターを使用するというアイデアは今回適用するかどうかまだ考え中ですが、新しい発想をいただくことができ、広がりました。ありがとうございます。 まずどの方法が最も確実で効率的かを考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.4919-8 - 2016/03/16 (水) 15:16:09 - PCR おお様、 情報を小出しにしてしまい、恐縮しております。 当方、floxedノックアウトマウスを作製しようとしており、そのターゲティングベクターを構築中です。ホモロジーアームをクローニングしようとしていますが、使用予定の制限酵素の認識配列がホモロジーアーム内に存在するため、その部位にsilent mutationを持たせることが目的なんです。 おお様ならquick change mutagenesisを何度か繰り返すことで目的のアンプリコンを得ますか？それとも・・・次に書かせていただきます。 >[Re:7] おおさんは書きました : > もしかしたら必要ないのかもしれませんけど、変異体だけじゃなくってWild typeも実験に必要な場合も多いと思うんだけど、、、ならばWild typeをとってから変異を入れるとかのほうがいいんじゃないの、、、とおせっかいながらに思った。

(無題) 削除/引用 No.4919-7 - 2016/03/16 (水) 13:06:16 - おお もしかしたら必要ないのかもしれませんけど、変異体だけじゃなくってWild typeも実験に必要な場合も多いと思うんだけど、、、ならばWild typeをとってから変異を入れるとかのほうがいいんじゃないの、、、とおせっかいながらに思った。

(無題) 削除/引用 No.4919-6 - 2016/03/16 (水) 12:50:29 - まずは ミューテーションが端だけなら、アダプターとしてつけてしまうという手も 当たりを引く確率が下がる懸念もありますが、PCRが失敗した場合に そのプライマーでもPCRはかかるでしょうけど、reverse primerの3'端はエクソヌクレアーゼ活性で高確率で除かれそうです あと、TAベクターとかTOPOとかPCR産物をそのままベクターに入れるなら、遊びの配列はいりません

(無題) 削除/引用 No.4919-5 - 2016/03/16 (水) 09:59:57 - PCR まずは様、おお様、AP様、 ご教示いただきありがとうございます。 自分の浅はかさに失望しています。 Nestedやtouch down PCRなど、考えが及ばない手法を提示していただきとても参考になります。また、まずはきちんとオリジナルを増幅して、手順を踏んでmutagenesisすること、その通りでした。もう一度プランから練り直すことにします。 私はゲノムを元に（cDNAではなく）、700 bpほどをPCRにて増幅させたいです。 primerの5'側には6つの遊びの塩基配列と、それに続く制限酵素認識配列 (Not1) を持たせた設計をしています。 つまり、Forward primerは以下のような配列になります。 5'- taataaGCGGCCGCxXxXXXXXXXXXXXXXXxXXxXXXXXXXXxXXxXXXX -3'です。 Not1配列に続く、37 ntのXはgenomeと相補的な配列です。 ただし、小文字のxは変異を持たせており、ミスマッチとなります。 Foward primerの5'側のミスマッチはPCRにおいて問題にはならないと思いますが、3'のミスマッチはアニーリングに影響し、最悪増幅できないのではないかと思えてきました。 同様に、Reverse primerは6つの遊びの塩基配列と、それに続く制限酵素認識配列 (EcoR1) を持たせており、配列は以下の通りになります。 5'- tcctccGAATTCXxXxXXXXXXXXXXXXXXXXx -3'です。（3つのミスマッチ） これも致命的なミスです。most-3'がミスマッチになっています。これでは肝心のPCRがかからないように思えてきました。 やはり、手順を踏んで、まずはオリジナルのものをきちんとクローニングして、その後、mutagenesisしていくことにします。今回の場合には、変異を持たせたい部位はPCRアンプリコンの中で中心部ではなく、むしろ、5'および3'側になります。しかもmost-5'やmost-3'からずいぶん中に入り込んだ部位になるため、primerに変異を持たせたPCRではご指摘のように上手くいかないと思われます。 やはり1もしくは2塩基を一度に変えるquick change mutagenesisを何度も繰り返して作るのが常法となりますでしょうか？cloningはこれまでにも経験があるのですが、これほど込み入ったコンストラクションは初めてとなり、無知や浅はかさを改めて実感しております。 おお様の言われる外側に広げていくというのは、inverse PCRを行うということでしょうか？ iPCRの経験はあります。それでしたら一度に5'側の6塩基を変えるのも難しくはなさそうな印象を持ちました。 何分経験が乏しいため、引き続き確認をさせていただけますと幸甚です。どうかよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4919-4 - 2016/03/15 (火) 14:51:14 - AP 出発材料からいきなり変異プライマー、しかもそんな長いのでPCRかけるんじゃなくて、ごく普通のPCRで標的配列を増やしてから、変異プライマーで変異を入れる おが王道かと。 いきなりやっても成功することはあるかもしれないけれど、 ・complexityの高いcludeばゲノムDNAから標的配列を単離する ・標的配列に変異を入れる どちらもPCRでやることでも、目的ごとに切り分けたほうがいい

(無題) 削除/引用 No.4919-3 - 2016/03/15 (火) 13:02:38 - おお 配列見てみないとなんとも言えないところはありますがかかるときはすんなりかかるもんです。片方を３００bsとかののPCRフラグメントをプライマーに用いてもかかるわけですし。タグ付きで５０b以上なんてプライマーはよく出てきます。 ひとつまえの4918のトピでも書いたんだがタッチダウンはやってみる価値があると思います。あとすでに上がっているNested。またはそれとほぼ同様ですが外側にプライマーを作ってPCRフラグメントを増幅してその断片を精製してからそのプライマーでPCR。 ミューテーションによるアニーリングが気になるなら内側に一部のミューテーションを含んだ領域をもつプライマーを設計して外に広げていくてもあります。 ゲノムの複雑性がPCRを難しくしているという視点から、その領域を含むBACなどのクローンを買うとか、もっと荒業はその領域が切れない制限酵素でゲノムを切って、期待されるsize前後のDNAをアガロースから切り取って抽出するなど。RNAとして発現しているならcDNAからという手もあるかと。

(無題) 削除/引用 No.4919-2 - 2016/03/15 (火) 12:26:00 - まずは nested PCR

PCR mutagenesis in primers 削除/引用 No.4919-1 - 2016/03/15 (火) 12:17:51 - PCR こんにちは。今、PCRにて目的の遺伝子をクローニングしたいのですが、わけあって、foward primerの長さは44 nucleotidesあります。Reverseもそれくらいの長さで、アンプリコンサイズは700 bpほどです。 templateはProKで処理したマウス尾由来ゲノムです。 実はforward primer（44 nt）内に6つの変異を持たせています。6つ連続しているわけではなく、まばらに散らばっています。今しがたprimerを注文しましたが、果たしてこれでPCRがかかるのか？という不安にかられ始めました。上手くいくでしょうか？ もしPCRバンドがでなければ、アニール温度を下げる以外に工夫はありますでしょうか？

全20件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---