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(無題) 削除/引用 No.4912-3 - 2016/03/11 (金) 23:58:17 - おお RNAの分解の可能性などはないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4912-2 - 2016/03/11 (金) 21:45:24 - AP >予備検討の結果、実験の処理による変動はないものと考えています。 これはどういう根拠からですか？ 逆転写効率が異なるからでしょう。逆転写効率はそれほど高くなく、うまくいって10-50%くらい、しかもサンプルごとにかなりぶれます。収量が低いRNAを投入量を増やしして逆転写しても、不純物の持ち込みも増えるために、逆転写効率が下がる可能性があります。 そういうことがあるからこそ、RNAの投入量でなく内部標準でnormalizeするわけです。

逆転写に用いたRNA量を反映しないReal Time-PCR？ 削除/引用 No.4912-1 - 2016/03/11 (金) 19:56:00 - hiro いつもお世話になっております。 以前から気になってはいたけれど、なんとなくスルーしていた問題について質問させてください。 現在ルーチンで、組織や細胞からRNAを抽出して逆転写後、リアルタイムPCRを行っています。 鋳型のRNA量は500ng/reactionで、TakaraのPrimeScript™ RT Master Mixを使用して逆転写しております。 その後のリアルタイムPCRはKAPA SYBR Fast qPCRキットを使用しています。 問題というのは、、、説明しにくいので具体例を書かせていただきます。 RNA定量の結果、 サンプルA：100ng/uL サンプルB：250ng/uL サンプルC：280ng/uL サンプルD：245ng/uL だったとします。 各サンプル500ngのRNAを使用して逆転写反応を行い、その後は同じ操作でPCRをかけました。 この系では内部標準で18Sを使っており、予備検討の結果、実験の処理による変動はないものと考えています。 なので、サンプルA〜Dの18Sの発現量はほぼ同じになるはず、だと思うのですが、 実際のPCRでは、まるで元のRNA量を反映したような発現量になっています。 つまり、サンプルAの18Sが他のサンプルの半分くらいの発現量になっているのです。 このような結果に、なんでだろう？思いながらも今まで見て見ぬふりをしていました・・・。 分かりにくい文章で申し訳ありませんが、このような現象が起こりうる理由について教えていただけましたら大変ありがたいです。 どうぞよろしくお願いいたします。

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