既に対象の遺伝子は絞られており、ヒストンのメチル化阻害剤でこの遺伝子の発現が変わる事も明らかです。遺伝子の発現がヒストンのメチル化によって直接調整されているという仮説を証明する方法を考えています。
メチル化の阻害剤で処理した細胞と処理しない細胞を用意して、
メチル化ヒストン抗体またはIgGでIPをしてこの遺伝子のプロモーター領域にプライマーを設定してQTーPCRをして比較すれば良いのではないかと考えています。
転写因子の研究では、結合予想配列が分かっているので、その領域を考えてプライマーを設定すると思います。
ヒストンメチル化に関してはどの領域にどのような基準でプライマーを設定するのかがよくわかりません。
ランダムに200bpごとに設定してピークのある部位を事前に検討するのでしょうか？
それとも、あまり気にせずに適当に設定してよいのでしょうか。因にこれまで、DNAのメチル化については検討されており、この領域にかんするプライマーの条件を知る事は出来ます。もし、どこに設定してもよいならこの領域を対象にしようかとも考えました。
論文をみると多くはCHIP-seqでピークを検討した上で実験を進めているのがおおいと思います。
これまでに、私の興味ある遺伝子のプロモターを対象としヒストンのメチル化をみている論文はありません。
プライマーの設定のしかたや、検討の仕方について教えて頂けないでしょうか。 |
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