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プラスミドについて トピック削除
No.4901-TOPIC - 2016/03/07 (月) 16:49:42 - c

　現在，あるタンパク質をアフィニティ精製するために，まず最初の段階としてプラスミドの構築を行っていました．プラスミドはMiniprepキットを用いて大腸菌から抽出しました．シーケンス解析を行ったところ，配列も正しく，電気泳動を行っても，しっかり目的のサイズのバンドが確認できました．
　しかし，目的のサイズバンドの上のほうひうっすらバンドが見えます．

質問事項は下記の4つです．

1.うっすら見えるバンドは開環状のベクターと考えてよろしいでしょうか．
2.この開環状のベクターが混じったまま，細胞への遺伝子導入は行ってもよろしいでしょうか．
3.この開環状が混じったまま実験を進めることによって最後にアフィニティ精製をする際問題が起こる可能性はあるでしょうか．
4.開環状ベクターを取り除く実験方法はどんなものがありますか．

初歩的なことかもしれませんが，ご指摘ご指導の程よろしくお願いいたします．
　
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(無題) 削除/引用
No.4901-7 - 2016/03/09 (水) 12:25:36 - 中年
原報にあたったことは無かったのですが、これかな？

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167478183901148

変性したものが有機層に分配されるところが、cccは変性されにくいということだと思います。ロスはあります。

(無題) 削除/引用
No.4901-6 - 2016/03/09 (水) 11:24:33 - AP
1. 開環状（open circular, OC)でよろしいかと。
ccc以外のフォーム（OC, linear)を完全に排除するのは通常困難です。ある程度混じってくるのは仕方がない。
かつては（高次構造がよく分かっていなかった頃）、ccc, OC, linearをform I, form II, form IIIと呼ばれていて、有り得べき姿の一つ一つであるとみなされていたくらいですから。

2. 構いませんことよ。上記のように、どうしてもある程度混じってくるものですし、細胞に導入されたプラスミドが発現をするくらいのことが起こるのであれば、OCのnickが放って置かれるはずもなく、修復されますはずですので、大して心配ないです。in vitro transcriptionなんかの鋳型に使うときは最大限nick-freeのプラスミドを精製するようにしますけど。

3. 実験上問題は特に無いです。しかし、あなたの認識に疑問がある。アフィニティー精製は手段であって目的ではないでしょう。目的の本質、問題点の本質がわかってないなあ、というのが最初に質問を見たときの感想。

4. 古典的にはEtBrをかませてCsCl密度勾配超遠心で分離し、cccの帯域を注射針で吸って精製します。最近では、過去トピにも何度か上がっている、T5 exonucleaseやATP-dependent DNase (商標　PlasmidSafe）でOCやlinearを分解してしまうという方法があります。acid phenol抽出は初耳。どんな原理で、どやってやるの？ 酸性条件でphenol抽出するとcccだってphnol層に分配されますよね。

(無題) 削除/引用
No.4901-4 - 2016/03/09 (水) 06:33:53 - 中年
acid phenol抽出でかなり除けます。

(無題) 削除/引用
No.4901-3 - 2016/03/07 (月) 17:09:56 - おお
>4.開環状ベクターを取り除く実験方法はどんなものがありますか．

古典的なやり方だと塩化セシウムを使って超遠心

(無題) 削除/引用
No.4901-2 - 2016/03/07 (月) 17:07:45 - おお
制限酵素処理をせずに流しているのでしょうか。ならばプラスミドのサイズはちょっと正確には見積もれませんね。。。酵素処理をしてないなら、CCCの少し上にLがありかなりサイズの高いところにOCが来ることが多いです。なのでおっしゃっているバンドがLかOCかわかりません。

ただ、CCCの量が９５％以上占めるならまずは経験的には大丈夫だと思っています。

よほど精製がまずかった場合は大腸菌のゲノムが混じったりしますが、それは実際の実験をやっている現場で見てないと指摘しにくいです。

プラスミドについて 削除/引用
No.4901-1 - 2016/03/07 (月) 16:49:42 - c

　現在，あるタンパク質をアフィニティ精製するために，まず最初の段階としてプラスミドの構築を行っていました．プラスミドはMiniprepキットを用いて大腸菌から抽出しました．シーケンス解析を行ったところ，配列も正しく，電気泳動を行っても，しっかり目的のサイズのバンドが確認できました．
　しかし，目的のサイズバンドの上のほうひうっすらバンドが見えます．

質問事項は下記の4つです．

1.うっすら見えるバンドは開環状のベクターと考えてよろしいでしょうか．
2.この開環状のベクターが混じったまま，細胞への遺伝子導入は行ってもよろしいでしょうか．
3.この開環状が混じったまま実験を進めることによって最後にアフィニティ精製をする際問題が起こる可能性はあるでしょうか．
4.開環状ベクターを取り除く実験方法はどんなものがありますか．

初歩的なことかもしれませんが，ご指摘ご指導の程よろしくお願いいたします．
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