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(無題) 削除/引用 No.4900-4 - 2016/03/07 (月) 14:55:00 - おお つくっとけって。今作って手元にあるやつはもしかしたら低発現用に使えるかもしれない。まあ違うところからの翻訳が優位になる可能性が無視できたとして。 ＞先輩からコザック配列は翻訳効率に関わるもので、mRNAの増加が認められたからと言って翻訳が出来ているかは別の問題だ、 別の問題だと思わないなら、その理由は何でしょうか。その先輩の意見に私は賛成です。

(無題) 削除/引用 No.4900-3 - 2016/03/07 (月) 13:14:59 - AP >ただ一応これをヒーラ細胞に過剰発現させたところ、mRNAの大幅な増加が見られたので、大丈夫だろう、と思っていたのですが、 >先輩からコザック配列は翻訳効率に関わるもので、mRNAの増加が認められたからと言って翻訳が出来ているかは別の問題だ、みたいなことを言われてしまいました。 しれっと言っちゃってますが、これは相当恥ずかしいことですぞ。 Kozak配列は決まった配列ではなく、頻度から導いたコンセンサスです。 今あるコンストラクトでKozakとどれくらい一致しているか、によっては発現の見込みがあります。全然、外れていたら作り直したほうが賢明です。 私なら、現時点で明らかな瑕疵が分かっているんだから、手を打っておきますね（つまり作り直しに着手する）。 今あるので十分に使えるという証拠が出て、もう必要ないのであれば途中で中止すればいいし、その前に完成したなら、両方試していいほうを使う。 発現するにはするが弱い、ってあとで分かって作り直すんじゃ時間的ロスが痛い。

(無題) 削除/引用 No.4900-2 - 2016/03/07 (月) 12:49:59 - 独り言 プラスミドをトランスフェクションしてmRNAをRT-PCRで見るのって、結構難しいような気がする。やったことあるわけじゃないけど、プラスミドがそのままRNA溶液にコンタミしたら、最終的に目的遺伝子をPCRしても本来のcDNAがプラスミドのコンタミか区別できないし。トランスフェクションしているプラスミドって、かなりの量ですからね。1%でもコンタミしたら、それだけでかなりPCRで増幅できちゃううでしょ。DNAse処理すれば除けるかもしれないけど、本当にそれで完全に除けたのか確認しているわけでもないでしょ。 それともmRNAの確認はノザンですか？それならサイズでmRNAとプラスミドを分けられるので、過剰発現しているかわかるので大丈夫でしょう。 実験目的にもよりますが、ちゃんと過剰発現させたいならコザック付きのプラスミドを私ならすぐに作る。少量でも発現すれば大丈夫な実験なら作らなくても実験はできるかも。

コザック配列についての疑問 削除/引用 No.4900-1 - 2016/03/07 (月) 12:13:15 - 小細工 プラスミドのコンストラクションを行っていますが、コザック配列というものを開始コドンの前に付けませんでした。先輩からは付けた方がいいと言われています。ただ一応これをヒーラ細胞に過剰発現させたところ、mRNAの大幅な増加が見られたので、大丈夫だろう、と思っていたのですが、 先輩からコザック配列は翻訳効率に関わるもので、mRNAの増加が認められたからと言って翻訳が出来ているかは別の問題だ、みたいなことを言われてしまいました。抗体でウエスタンすればいいのですが、コンストラクションのし直しをすぐに取りかかった方がいいでしょうか？

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