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(無題) 削除/引用 No.4899-8 - 2016/03/07 (月) 08:40:46 - bsl HindIIIがユニークなら、そこに薬物耐性遺伝子を入れるのが楽な気がします。 ウィルスの構成要素が何を指しているかにもよりますが、実験室の設備は適切ですか？ 組換え実験の申請はちゃんとしてますか？ 増幅できるようになると問題になる場合も有りますよ。 知識がない領域ということなので、心配になります。

(無題) 削除/引用 No.4899-7 - 2016/03/07 (月) 01:47:55 - おお 市販ということなので、商品名とか上げてみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4899-6 - 2016/03/06 (日) 20:56:11 - mon あっ、すいません。以下の文を見落としていました。 > このプラスミドはあるウイルスの構成要素の一つを発現させるためのものです。 HindIIIで直線化してしてあるのかな？self-ligationしてトランスフォーメイションできるかも。

(無題) 削除/引用 No.4899-5 - 2016/03/06 (日) 20:51:57 - mon > プラスミドの全長は7 kbほどで、目的の発現ユニットとして、 > 「CMVプロモータ」-「SV40 late 16s Intron」-「ウイルス構成要素」-「SV40 poly-A」-「Hind III」と書かれてありました。 「ウイルス構成要素」の長さ次第ですが、7 kbのplasmidであれば、記載がないだけでAmpかKn耐性遺伝子も入っていると思います。 CMVプロモータ:800bp程度、SV40 poly-A:400bp程度、SV40 late 16s Intron：100bp程度です。 もしかして、レンチ（レトロ）ウィルスのパッケージングプラスミドですか？もしそれなら２〜３種のplasmidの混合物で、クローン化して分離可能です。試しに10pg~1ngほどtransformationしてAmp plateかKn plateにまいてみれば。

(無題) 削除/引用 No.4899-4 - 2016/03/06 (日) 20:03:39 - 独り言 ウイルスの遺伝子部分だけ、他のベクターに入れれば問題ないでしょう。 というよりも、そのような薬剤耐性のないベクターというのは初めて聞きました。そもそもその会社はどうやって作ったのですかね？？？

(無題) 削除/引用 No.4899-3 - 2016/03/06 (日) 17:43:38 - おお あ、ATGからと書きましたが、ATG前後の配列が翻訳スタートに影響するようなので、ATGから６ベースぐらい上流は含めてもいいかもしれません。またATGから６ベーすぐらい上流の途中でイントロンで分断されているなら、イントロンを入れたほうがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4899-2 - 2016/03/06 (日) 17:39:14 - おお >[Re:1] TKTさんは書きました : > > これを例えばpcDNA3.1+などにクローニングできればと考えています。 > ただ、ウイルス構成要素の全長の配列は分かっておらず、シークエンスで全長読むことは可能だと思いますが、発現ユニットとしてpcDNA3.1+のMCSに入れるべきものはウイルス構成要素だけでいいのでしょうか？ 構成要素って蛋白がコードされているんでしょうか？それなら最初のATGからストップコドンまであれば十分です。 >おそらくintronは発現効率を上げるためのものと推測しています。知識がない領域ですので、詳しい方々からご教示いただけますと幸いに存じます。よろしくお願い致します。 イントロンを入れたほうがよく発現するという話もあって、発現ベクターにイントロンを入れているプラスミドはいくらかあります。pCDNA３などは入っていないタイプで、それでも発現はしますので、基本的に必要はないのだと思います。ただ入れる事により発現量が上がる可能性（あくまでも可能性として）はあります。逆にあまりいじくると下がっちゃうという可能性もないわけではありません。あくまでも蛋白発現のはなしです。

市販の増幅できない仕様のプラスミドの増幅 削除/引用 No.4899-1 - 2016/03/06 (日) 15:07:16 - TKT よろしくお願い致します。 コマーシャルなプラスミドの購入を検討しています。 このプラスミドはあるウイルスの構成要素の一つを発現させるためのものです。 ただし、このプラスミドには薬剤抵抗性遺伝子が入っておらず、使い切りの使用ということになっています。質問はこのプラスミドをどうにか増やせられないか？ということです。 プラスミドの全長は7 kbほどで、目的の発現ユニットとして、 「CMVプロモータ」-「SV40 late 16s Intron」-「ウイルス構成要素」-「SV40 poly-A」-「Hind III」と書かれてありました。 これを例えばpcDNA3.1+などにクローニングできればと考えています。 ただ、ウイルス構成要素の全長の配列は分かっておらず、シークエンスで全長読むことは可能だと思いますが、発現ユニットとしてpcDNA3.1+のMCSに入れるべきものはウイルス構成要素だけでいいのでしょうか？それともSV40 late 16s Intronも必要でしょうか？おそらくintronは発現効率を上げるためのものと推測しています。知識がない領域ですので、詳しい方々からご教示いただけますと幸いに存じます。よろしくお願い致します。

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