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(無題) 削除/引用 No.4897-12 - 2016/03/06 (日) 17:22:40 - protein+dye おお様 キットや試薬調製ほうほうで許容範囲が違ってくるんでしょうかねぇ。。。5xを１xとして使っているとか、、、ないですよね。。。。 このことへの回答のつもりでした。 detergentのstockをx5とかそういうのがあるということかなと思ったのですが・・・。 と、返事を書いていて気づきました。 Dyeのことですね！ ちゃんと蒸留水でx1に希釈して使用しています。 ろ紙で濾過もしています。

(無題) 削除/引用 No.4897-11 - 2016/03/06 (日) 16:03:28 - おお >ただ、少なくとも調整しているLysis bufferの濃度が私の記載したものと異なっていることは、ない「はず」です。 そんなこと指摘しましたっけ。。。

(無題) 削除/引用 No.4897-10 - 2016/03/06 (日) 14:54:15 - protein+dye おお様 理解が悪く、すみません。 また、細かく御記載いただきまして、 ありがとうございます。 説明書を読み違えていたようです。 detergentの濃度につき、ご指摘ありがとうございます。 ただ、少なくとも調整しているLysis bufferの濃度が私の記載したものと異なっていることは、ない「はず」です。 Stock溶液もすべて自分で調整したものですので。 タンパク濃度も参考になりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4897-9 - 2016/03/06 (日) 12:58:37 - おお >WBやIPでたいてい使いやすいのは１から２mg/ml（Lysis buffer中, ブラッドフォード試薬中の濃度で２から４ug/mL）。 これはあなたの系（２マイクロを１mlにいれる）場合です。

WB re-probing 削除/引用 No.4897-8 - 2016/03/06 (日) 12:28:51 - おお >[Re:7] protein+dyeさんは書きました : >[Re:7] protein+dyeさんは書きました : > おお様 > > Lysateを2倍希釈して2倍入れる、ですね。 > 今後検討してみます。 > ちなみに、CHAPSで希釈と今回用いたLysis bufferで倍に希釈するのと、 > 違いがあるのでしょうか。 > （Lysis bufferの組成に問題がなければ）無い気がするのですが。 だから、サンプルがアグル（凝集）するのを防ぐためになるべく多くのデタージェントをいれたらといっているではないですか。。。 > > DOCの上限は0.1%と記載されていたと思います。 > NP40とSDSはぎりぎりだったと思います。 バイオラッドのBradford試薬は、１mlに２０マイクロL入れることができて、その時のDOCの上限が0.1%となっています。あなたは２マイクロLしか加えてないので、バイオラッドによるとあと１８マイクロLの0.1%DOCを加えても定量できるはずです。SDSの上限はバイオラッドの試薬では０.１％になってます。 http://www.bio-rad.com/LifeScience/pdf/Bulletin_9004.pdf 上記のページ２に上限の濃度が書かれています。ただしNP-40のじょうほうがここにないので、 http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf こちらでは２５０マイクロLのけいで５マイクロいれるとき、上限としては０.２５％になっています。 > 実際、Lysis bufferのみでも5uLとか入れると、かなり真っ青になります。 > （界面活性剤NP40のみでも同じでしたが） キットや試薬調製ほうほうで許容範囲が違ってくるんでしょうかねぇ。。。5xを１xとして使っているとか、、、ないですよね。。。。 > > 私はDyeが若干は青みがからないと不安で、 > 測定溶液の濃度でいうところの10ug/mL近くになるように調整しています。 >... > ちなみにどれくらいの濃度に調整しておられますか。 WBやIPでたいてい使いやすいのは１から２mg/ml（Lysis buffer中, ブラッドフォード試薬中の濃度で２から４ug/mL）。あまり濃度が高いと、抽出効率が落ちていそうな気がするので、それぐらいで落ち着くようになっています。組織からだともう少し高いこともあります。またあまりにも濃いままサンプルバッファーをいれてボイルすると、ボイルで蛋白が凝縮したりしますので、それも避けるためにあまり高くしません。 ただし、核タンパク抽出などで樹立されたプロトコールで５mg/ml以上になるようなものもありますが、それはそういう方法ですので、そのプロトコールに従ってます。

(無題) 削除/引用 No.4897-7 - 2016/03/05 (土) 20:29:18 - protein+dye おお様 Lysateを2倍希釈して2倍入れる、ですね。 今後検討してみます。 ちなみに、CHAPSで希釈と今回用いたLysis bufferで倍に希釈するのと、 違いがあるのでしょうか。 （Lysis bufferの組成に問題がなければ）無い気がするのですが。 DOCの上限は0.1%と記載されていたと思います。 NP40とSDSはぎりぎりだったと思います。 実際、Lysis bufferのみでも5uLとか入れると、かなり真っ青になります。 （界面活性剤NP40のみでも同じでしたが） 記載した濃度はどちらも測定溶液の濃度です。 Lysate原液の濃度ではありません。 紛らわしい記載でした、失礼しました。 スタンダードも同じLysisで調整、 たしかに当然それがbetterと思っています。 ただ、共用の調整済みSDS溶液があったので、 それを利用してきました。 私はDyeが若干は青みがからないと不安で、 測定溶液の濃度でいうところの10ug/mL近くになるように調整しています。 （SDSで書いた検量線は20ちょい過ぎ位までは綺麗な直線です、 この前の実験ではR2=0.998とかになりましたし） ちなみにどれくらいの濃度に調整しておられますか。

(無題) 削除/引用 No.4897-6 - 2016/03/05 (土) 16:21:53 - おお >[Re:5] protein+dyeさんは書きました : > おお様 > > ありがとうございます。 > CHAPSとは3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonateのことでしょうか。 Yes > 界面活性剤ですよね。 Yes > Lysateを希釈して、測定してみるということでよろしいのでしょうか。 ２希釈して、ボリュームが増えてもいいので二倍量入れてもいいんじゃないかな。界面活性剤でブラッドフォードでは高い濃度でも影響が殆ど無いデタージェントのようなので、アグルのを防ぐのにいいかと。。２５０マイクロLの系で１０％Chapsを５まいくろL加えても大丈夫なようです。 > 50mM Tris, 150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% DOC, 0.1% SDS, 1mM NaF, 1mM EDTA, Protease inhibitor cocktail x1(life tech), 2mM Na3VO4, 1mM beta glycerophosphate, 10mM Na4P2O7 > 界面活性剤の濃度がBradford法を使用する上でOverしているものがあることは認識しています。 > Dye １ｍL中に、Lysateを2uL加え、吸光度を測定して定量しています。 その方法で許容範囲をオーバーしているのはありますか？１０マイクロL入れても大丈夫な気がする。NP-40がTritonX100だったらギリギリかもしれないけど。NP-40とTritonX100ほぼ同じケミカルなのにNP-40が多く入れても大丈夫なところが不思議だけど。 > サンプルの濃度が5-10ug/mLとなるようにしていますが、 > Lysis bufferのみを測定しても、1.21ug/mLと値が出ます。 スタンダードも同じバッファーで調製して、バッファーだけを加えたのを０として検量線を書いてください。下駄を差し引けますし、その上でのバッファーによる影響下での直線性が確認できるはずです。 ただ、そんな低いタンパク量がはかれますか、、、それともブラッドフォードに入れたときの溶液でそのぐらいの濃度ということですかね。そうだとすると、ライセートのタンパク量がちょっと多いなぁ。下の方はまあいいとして、上の方は特に。2倍ぐらい薄くてもいいかなとおもう。

(無題) 削除/引用 No.4897-5 - 2016/03/05 (土) 12:24:08 - protein+dye AP様 ありがとうございます。 ・Bradford試薬は酸性なので、アクトミオシンの等電点と一致した？ ・酸性のためリポタンパク質などに由来する脂質が含まれていると沈殿を生じるらしい。 アクトミオシンか脂質の沈殿ですか。 アクトミオシンの方が可能性が高そうな気がします。 沈殿物がDyeで青く染まっていましたので。 別の蛋白測定法も考慮する必要があるということですね。 論文でもbradford法でmuscle lysateの蛋白量を測定しているものがあるのですがね。 もしかしたらLysis buffer中の一部の試薬と相性が悪かったのかもしれませんね。(組成は下記) おお様 ありがとうございます。 CHAPSとは3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonateのことでしょうか。 界面活性剤ですよね。 Lysateを希釈して、測定してみるということでよろしいのでしょうか。 とも様 ありがとうございます。 肝臓と骨格筋でおなじLysis bufferを使用しました。 組成は下記です。 50mM Tris, 150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% DOC, 0.1% SDS, 1mM NaF, 1mM EDTA, Protease inhibitor cocktail x1(life tech), 2mM Na3VO4, 1mM beta glycerophosphate, 10mM Na4P2O7 界面活性剤の濃度がBradford法を使用する上でOverしているものがあることは認識しています。 Dye １ｍL中に、Lysateを2uL加え、吸光度を測定して定量しています。 サンプルの濃度が5-10ug/mLとなるようにしていますが、 Lysis bufferのみを測定しても、1.21ug/mLと値が出ます。 （界面活性剤をNP40だけにしても同じだったので、Overを承知でDOC、SDSを入れるようにしました） Lysis分の下駄を考慮してサンプル調整はしています。 なにか、思い当たる点はございますでしょうか。 骨格筋（今回は腓腹筋とヒラメ筋）のサンプリング経験の有無にかかわらず、 なんでも示唆を頂ければと思います。 あらためて、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4897-4 - 2016/03/04 (金) 22:46:55 - とも lysisに使ったdetergentの影響はどうでしょう。肝組織では大丈夫とのことですが、同じlysis bufferですか？

(無題) 削除/引用 No.4897-3 - 2016/03/04 (金) 22:40:16 - おお CHAPSなら１０％ぐらいまで大丈夫だから１０％CHAPSみたいなストック溶液と１：１ぐらいで希釈して図ってみる？

(無題) 削除/引用 No.4897-2 - 2016/03/04 (金) 21:09:00 - AP ・Bradford試薬は酸性なので、アクトミオシンの等電点と一致した？ そういうことが起こるなら、原理上、少なくとも既製品の試薬ではどうもならないなあ。 ・酸性のためリポタンパク質などに由来する脂質が含まれていると沈殿を生じるらしい。 http://pdbu-support.bio-rad.co.jp/answers/841.html クロロフォルム、エーテルなどで抽出して脱脂するか？

bradford法での蛋白量測定時に沈殿形成、解決法は？ 削除/引用 No.4897-1 - 2016/03/04 (金) 20:09:43 - protein dye 参考にさせていただいております。 動物組織サンプルをwestern blot用にサンプリングする際に、 総蛋白量を合わせるために蛋白質濃度を測定します。 私はBradford法(バイオラッドのprotein assay dye）で測定しているのですが、 骨格筋組織のLysateの時に、沈殿物が出来てしまいました。 （蛋白質と色素の複合体が沈殿することがあるそうではあるのですが、 今回出来た沈殿がこれかは不明です。） 肝臓のLysateの時には沈殿はできませんでした。 沈殿が形成されないようにする、 沈殿を溶解させる等、 解決法をご存知の方がおられましたら、 ご教授いただければと思います。 よろしくお願い致します。

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