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(無題) 削除/引用 No.4888-9 - 2016/03/13 (日) 18:45:46 - hansen 度々ありがとうございます。 出芽酵母の種に関しては一倍体で、掛け合わせが出来ないものです。仰る通り、マーカーを用いた変異が良さそうなので、自作も含めて検討を続けようと思います。重ねてお礼を申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.4888-8 - 2016/03/09 (水) 06:25:14 - 弘法 次世代シーケンサーを用いた変異同定の原理については、下に示す原報のFig.2を見れば直観的にわかると思います。 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/gtc.12151/epdf ただし、バッククロスしてprogenyを得る操作が不可欠なので、No.4888-5に書いたように「掛け合わせが可能な種」でないとこの方法は使うことができません。

(無題) 削除/引用 No.4888-7 - 2016/03/09 (水) 06:17:34 - 弘法 5,000株が多いとのことですが、網羅的であるためにそれ以上の候補をスクリーニングしなければならないことは、変異導入にどのような手法を用いようとも変わらないと思うのですが。 また、変異原処理で多数の変異が導入されることはそのとおりですが、No.4888-5でお示ししたウェブツールは、そのような場合に親株と一回のバッククロスを行い、求める表現型を示すprogenyと示さないprogenyをそれぞれ複数株混ぜてシークエンスを行い、表現型を示すprogenyのみに有意に濃縮される変異を探すもので、無関係に存在する変異や多型は原理的に問題になりません、というかそこがミソの方法論です。 あくまで挿入変異にこだわりたいのであれば、その酵母のゲノム配列に存在しない（あるいは相当するゲノム領域を完全に欠失させた）マーカー遺伝子で形質転換すれば、ゲノムに（比較的ランダムに）挿入されることが期待できるので、そこから求める表現型を示す株をスクリーニングするという方法も可能でしょう。同様な方法をアグロバクテリウムを用いた形質転換で行っている論文も見たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.4888-6 - 2016/03/08 (火) 21:00:17 - hansen 度々ありがとうございます。 ゲノムサイズの「のべ」というのは複数本のゲノムの総和という意味で書きましたが、国語辞典で勉強し直したところ不適切な表現のようで失礼しました。 「数が多すぎて逆にカバーし切れない」というのは我々が持っているcerevisiaeのcollectionの変異体の数が5,000程度あり、それら全てを解析するのが大変という意味です。 次世代シークエンスについては上司に聞いてみましたが、mutagenic agentsはかなりの変異を導入するので、次世代シークエンサーのみでは効率的ではないようです。 外注先を探すのはかえって大変なので、リーズナブルな方法を習得して自分達でやった方がいいかなと考えています。

(無題) 削除/引用 No.4888-5 - 2016/03/05 (土) 21:21:09 - 弘法 ゲノムサイズが「のべ」というのが何を意味するのか私にはわからないのですが、もしゲノムサイズが10Mb程度ということであればSaccharomyces cerevisiaeと同じくらいですよね。点変異を同定できる程度の精度を求めるなら、次世代シーケンサーの１回のrunで４サンプル（もしくはそれ以上）は配列を決定できると思います。トランスポゾンでmutagenesisする操作を外注するコスト（もし、そのようなものがあるとして）に比べれば、はるかに安価なのではないですか？ ゲノムが既に決定されていてreferenceになる配列がある酵母で、かつ掛け合わせが可能な種なら、下のツールを使えばほとんどワンクリックで変異を同定することができます。 www.yeast.umin.jp/yeast-symposium21/abstract21-34.pdf そうでなくても、ちょっと面倒かもしれませんが、原因変異の同定は可能だと思います。 追補 「数が多すぎて逆にカバーし切れない」というフレーズが（も）、何を指すのかわかりません。

(無題) 削除/引用 No.4888-4 - 2016/03/05 (土) 16:47:32 - hansen ありがとうございます。 生物種に関してはcerevisiaeでもpombeでもないマイナーな出芽酵母で、既成品は無いと思います。cerevisiaeのライブラリーは既に買ってそれでも解析していますが、数が多すぎて逆にカバーし切れないのと、やはり目的の出芽酵母で行いたい次第です。 次世代シークエンスについては、トランスポゾンのように後付けで変異箇所を特定する仕組みが無くても (マーカー無しでも)、丸ごとシークエンスすれば良いということでしょうか？自分でも調べてみようと思いますが、出芽酵母とはいえゲノムはのべ10Mbpに及ぶので、リーズナブルなコストで行えるものなのかと思います。

(無題) 削除/引用 No.4888-3 - 2016/03/01 (火) 15:03:56 - 弘法 今なら次世代シーケンサーで全ゲノム配列を決定することは容易ですから、トランスポゾンなど用いずとも昔ながらの変異原処理で変異株を取れば良いように思います。

(無題) 削除/引用 No.4888-2 - 2016/03/01 (火) 14:27:18 - おお すでにライブラリーがあると思うんだけど。どこでとりあつかってたかなな。。。オリジーンとかサーモ経由で注文できたりしたようなきがする。 cerevisiae以外だとないかもしれませんけど。pombeはどうかなぁ。。。

酵母の網羅的変異体作製の受託 削除/引用 No.4888-1 - 2016/03/01 (火) 13:43:00 - hansen 出芽酵母の一種に対し、トランスポゾンあるいはその他の方法で非特異的・網羅的に変異導入を行い、注目している機能に関連のある遺伝子を探索しようと考えています。しかし、網羅的な変異導入のノウハウが無いので外注したいのですが、そのような受託があるメーカーを御存知でしたら教えて頂けるようお願いします。

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