BioTechnicalフォーラム [二重染色の一方が染まらない]

二重染色の一方が染まらない

No.4884-TOPIC - 2016/02/29 (月) 12:07:16 - もも

いつも勉強させていただいています。
蛍光で二重染色をしているのですが、うまく染まらず、質問させていただきました。

HeLa細胞についてα-tubulin(fitc-conjugate:sigma:F2168)とAurora B(Alexa 647 conjugate:abcam:ep1009y)を染めようと、一からプロトコルを作成し実験しています。
tubulinについてはきれいに染まるのですが、aurora Bが全く染まらず困惑しています。どうかアドバイスお願いします。
以下、作成したプロトコルです。

○チャンバースライドで細胞を培養
①PBS（37℃）　15秒
②cold methanolで固定　10分（-20℃）
③PBS　5分×3回
④0.2%triton X-100　 5-15分（4℃）
⑤PBS　5分×3回
⑥ブロッキング（1.5％BSA/PBS）15分
⑦PBS　5分×3回
⑧ブロッキング溶液:tubulin:aurora B=100:1:1　オーバーナイト（4℃）
⑨PBS
⑩DAPI：ミリQで希釈して使用　室温15分
⑪封入
⑫シーリング

なお、aurora Bを50倍希釈にしたり、PFA固定にしても染まりませんでした。

どうぞよろしくお願いします。
　

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No.4884-10 - 2016/02/29 (月) 23:18:09 - ほぷほぷ

濃すぎるとワークしない抗体にあたったこともありますよん

(無題)

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No.4884-9 - 2016/02/29 (月) 20:11:49 - もも

ご回答ありがとうございます。
ご指摘のところを抜かして検討してみます。

(無題)

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No.4884-8 - 2016/02/29 (月) 17:22:07 - mon

(2)cold methanolで膜透過処理もできているので、(4)(5)は不要でしょうし、かえって悪影響を及ぼすかも。

(無題)

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No.4884-7 - 2016/02/29 (月) 15:40:40 - もも

早速のご回答ありがとうございます。
顕微鏡については他の647で観察しているため、問題ないかと思います。
単染色は行っておりませんので、一度やってみます。
たしかに抗体がそもそも機能しているのかはわからないですね（汗）
仮にワークしていない場合、交換など可能なのでしょうか。

(無題)

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No.4884-6 - 2016/02/29 (月) 13:13:36 - abcam

>[Re:5] Kittyさんは書きました :
> AuroraBに対する抗体がワークしているかどうかを、

http://www.abcam.co.jp/aurora-b-antibody-ep1009y-alexa-fluor-647-ab197614.html
メーカーのデータなので信頼できるかは別として

(無題)

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No.4884-5 - 2016/02/29 (月) 13:10:06 - Kitty

失礼,

anti-AuroraBに対する抗体がワークしているかどうかを、
↓
AuroraBに対する抗体がワークしているかどうかを、

(無題)

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No.4884-4 - 2016/02/29 (月) 13:08:42 - Kitty

anti-AuroraBに対する抗体がワークしているかどうかを、
確認してからおこなうべき実験ですね。

AuroraB-HAなどを細胞に発現させて (タグはなんでも可)、
anti-HAかつanti-AuroraBで染まるかは確認されていますしょうか。

(無題)

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No.4884-3 - 2016/02/29 (月) 12:45:59 - み

そもそも抗体がワークするのか？
６４７が見ることができる顕微鏡なのか？