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(無題) 削除/引用 No.4883-4 - 2016/02/29 (月) 13:33:17 - green あれ？ Ct値が低いと書いてるのに、発現量が低いと書いてるな。 よくわからないですね。 どこかに認識の間違いがあるのか、ただ記載を間違えたのか。

(無題) 削除/引用 No.4883-3 - 2016/02/29 (月) 13:30:02 - おお >サンプルのCT値は20前後で、添加濃度を下げてもCT値が変わらないことから下限だと考えています。 ここがかなり問題だと思いますが、、、 しっかりかかっているようにみえるけど、プライマーダイマーが増えていてそれがきれいなシングルバンドに見えているってことはないでしょうか？検量線はなにを使ってますかプラスミドとかですか？

(無題) 削除/引用 No.4883-2 - 2016/02/29 (月) 13:21:46 - green ちょっと文章がわかりずらいので、ちゃんと理解できてないかもしれませんが。 Ct値が低すぎるということは、発現が強すぎるということですよね。 ひとまず、サンプルの希釈系列を作ってみてはどうでしょうか。 PCR後のバンドを確認したのは、qPCRと同じプライマーですか？ melting curveのピークは一つでしょうか。

発現量が低い遺伝子飲むRT-PCR 削除/引用 No.4883-1 - 2016/02/29 (月) 12:04:49 - 困り中 初めまして。いつも勉強させてもらっています。 現在、ある遺伝子のmRNAの発現を増幅させる素材のスクリーニングをRT-PCRを用いて行っています。しかし、毎回CT値低すぎて検量線にのらず、どのサンプルのCT値用いてほぼ同じ〔おそらく下限値〕になってしまい困っています。 RT-PCRはSyber green を用いて3Step〔95℃ 62℃ 72℃〕で実施しています。 検量線は全サンプルをmixしてpcrにて増幅したものを段階希釈して使っています。 検量線に用いる前にpcr産物を電気泳動にかけていますが、綺麗なバンドが出ています。Primerの増幅効率は92%程度です。 housekeeping遺伝子のActinは問題なく定量できていることから、RNAの抽出が少ないわけではないと思います。RNAの純度も問題ありません。 気になっているのは、検量線が直線になるのがCT値18-19くらいまでと低すぎるのはないかということです。サンプルのCT値は20前後で、添加濃度を下げてもCT値が変わらないことから下限だと考えています。 長くなりましたが、定量するために改善点がありましたらご教示いただきたいと思います。

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