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(無題) 削除/引用 No.4883-24 - 2016/03/08 (火) 13:32:15 - おお それはあなたの系でどのようにワークしているか次第でしょう。理想的には３５も回せば１コピーは検出できますから、そのあたりではたまたまピペットに１コピー入ったか、２コピーははいったか、全然入らなかったかでばらつきが大きくなってきます。 まあそういうことを考えるともう少し早くに検出できる方がいいのは確かです。さいしょのRNA量かPCRに持ち込むcDNA量が上げれるならそれも手かもしれません。そのほかもしやってなかったら、スペシフィックプライマーのRTとかいろいろ工夫はできると思いますが。

発現量の低い遺伝子について 削除/引用 No.4883-23 - 2016/03/08 (火) 09:47:45 - 中々？ 皆様、初めまして。 リアルタイムPCRについてお聞きします。 現在、二つの遺伝子について相対定量で解析しているのですが、ハウスキーピング遺伝子の方は立ち上がりが早くて18サイクルくらいから見えるのですが、目的の遺伝子については30サイクル以降にしかシグナルが見えません、、、立ち上がりは30くらいからです。 これは果たして発現しているといえるのでしょうか？ もはや希釈する段階でもなく、原液でいつも見ています。 発現しているかいないかわからないものなので困っております。

(無題) 削除/引用 No.4883-22 - 2016/03/07 (月) 10:45:29 - まめ ampliconだけっていうのはずるい（PCR的に有利という意味）と思ってる ＋ 少なすぎて薄めにくい ので、RTの時は短くしたゲノム溶液を溶媒にしたりします。

(無題) 削除/引用 No.4883-21 - 2016/03/07 (月) 01:50:30 - おお 発現量の高いcDNAを使う人はおおいように思えます。

(無題) 削除/引用 No.4883-20 - 2016/03/06 (日) 18:22:47 - protein+dye 鬼武者様 私も毎度何かしらのスタンダードを置いた方がいいと思い、 検討を行ってきました。 みなさまはどの方法で行っているのかと思い、 便乗質問いたしました。 おお様 一概にどれが良くて悪いというものではない、という意見、 実際のところはそうなのだと思います。 で、実際みなさんはどうしておられるのですか、 という点が私の質問です。 (私はampliconを段階希釈したものを引き続き使おうという気で、今はいますが)

(無題) 削除/引用 No.4883-19 - 2016/03/06 (日) 11:52:09 - おお 一概にどれがだめでとかいえませんね。 ddCtはたしかにラフではありますが、使っている系で最初にスタンダードをとりながらddCtで遜色がないことを確かめてから使っている人もいるかもしれません。qPCRのばあいとくにRT-qPCRは定量的な方法とはいっても、mRNA等の発現をを見るときに正確な定量的数字が必要と考えてない場合も多いと思いますし。プラスミドやPCRフラグメントをスタンダードにとるのは理想的な環境下でどの程度ワークしているかという観点ではベストです。でcDNAなどか同じ環境と言えるかはそれを示すのは難しいですが、サンプルを数倍に希釈したものを同時に走らせば見当がつくはずです。またcDNAはDNAフラグメントからのPCRに比べ理想的環境でないというなら、スタンダードは一番強い発現から希釈してとればいいとする意見もあります。まあそうですが、希釈したcDNAが低発現のTestでつかっているcDNAとは同じ環境ではないとツッコミもできます。cDNAからqPCRするととくに高発現で検量線が寝てくるようで、なるべくcDNAからスタンダードを取る方がいいという人もいます。

(無題) 削除/引用 No.4883-18 - 2016/03/05 (土) 23:55:10 - 鬼武者 ddCt法の方が邪道でしょ。 毎回、PCR効率をださずに定量するなんで俺にはできませんね。 網羅的解析には、ddCt法はいいですが。

(無題) 削除/引用 No.4883-17 - 2016/03/05 (土) 20:48:51 - protein+dye 便乗して質問してもよろしいでしょうか。 (御法度でしたら別でトピックを立てますので、ご教授ください） >[Re:5] 困り中さんは書きました : > ＞検量線はなにを使ってますかプラスミドとかですか？ > 実際のサンプルから抽出したRNAからcDNAを作成し、PCRにて増幅後、PCR産物を段階希釈して検量線を作成しております この方法って一般的ではないと思うのですが。 一度PCRで増やした産物をさらにテンプレートに使う訳ですよね？ 絶対定量するわけではないのなら、ddCt法で比較してはいけないのですか？ 私も、困り中さんと同じ方法でスタンダードを作製していました。 最初に教わったのがこれでしたので、 これも一般的な方法と思い込んでいました。 スタンダードをどうしておられるのでしょうか。 一般的には(私にとっての一般的は崩れ去っているわけですが)、 スタンダード用プラスミドを作る、 測定サンプル中の一番濃そうなものを段階希釈する、 検量線は引かずにddCtで行う、 といったところでしょうか。 パッとは思いつかないですが、 その他の方法もございますでしょうか。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4883-16 - 2016/03/04 (金) 20:37:06 - 悪地蔵 Primerの配列は大丈夫でしょうか？ genome DNAでも増幅可能なPrimer配列であった為にRNA抽出時に除去していなかった genome DNAを増やしていたという経験があります。 BlastなりUCSCのBlatなりで調べていることをお勧めします。 >＞１８、１９サイクル以降検量線が寝てきて、その状態で直線性があるとか >ないでしょうか。ようするの１８、１９サイクルまでは物が多すぎて > 何か違うものを見ているとか。 > >１８、１９サイクル以降はＣＴ値がほとんど変わっていない > （ＣＴ値１９−２１程>度）ので、物が多すぎるわけではないのかなと >考えています。 > 　Amplification plotとCt値を混同しているかのようにも見えますが、 私の勘違いでしたら申し訳ありません。 　ある程度の直線性を持って、検量線として使用出来そうなCtの範囲は どれぐらいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.4883-15 - 2016/03/04 (金) 19:49:40 - Ano Primer Blast使ってみる

(無題) 削除/引用 No.4883-14 - 2016/03/03 (木) 11:04:15 - まめ 試薬濃度とかの操作上の失敗がないとして、 サンプルの希釈列で増幅程度の差が出ないなら，これでは定量できない、と判断するしかないと思います（スタンダードの問題はその次）。 既報のプライマーが使えないのは珍しいことではないし、 温度とかの条件検討をするよりプライマーを設計し直すのが一番早い安い、 というのが自分の経験です。

(無題) 削除/引用 No.4883-13 - 2016/03/01 (火) 11:56:11 - おお >[Re:12] 困り中さんは書きました : > > �@qPCR増幅産物のシークエンスを確認して、目的のモノが増えているか確認する（コンタミしたものを検出しているだけかもしれない？） 目的のモノが増えているか確認するのはコンタミと言うよりは、非特異な配列が増幅されている可能性を考えてのサジェスチョンだとおもいます。 コンタミというのはあなたの扱っている試薬などの中に目的の配列をもつDNAが混じってしまい、試料のcDNAからの増幅を見ているのではなくて、コンタミした（配列は特異的だけど）DNAを増幅している可能性を指摘しているわけで、こちらの対処も必要かもしれません。 > > �Aプライマーを変えてみる > 　（仮にテンプレートを今のやり方のままとすると、qPCRとプライマーを変える必要がありますでしょうか） 非特異な配列の増幅であればプライマーを換えないと解決しないかもしれません。 単純にプライマーの濃度を間違えているとかないでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.4883-12 - 2016/02/29 (月) 16:46:25 - 困り中 皆様 様々なご指摘ありがとうございます。 まずご質問について ＞１８、１９サイクル以降検量線が寝てきて、その状態で直線性があるとかないでしょうか。ようするの１８、１９サイクルまでは物が多すぎて何か違うものを見ているとか。 １８、１９サイクル以降はＣＴ値がほとんど変わっていない（ＣＴ値１９−２１程度）ので、物が多すぎるわけではないのかなと考えています。 ＞添加濃度を変えていると言われてますがどのぐらいの範囲ですかね？ 希釈倍率は10^-1から10＾-10まで検討しましたが、10＾7以降は検量線が寝てしまいます。 検量線の定量範囲が狭いことも問題ですが、サンプルのＣＴ値を小さく（早いサイクル数で検出できる）してきちんと定量できるようにするにはどうすればよいでしょうか。 皆様の御意見をまとめると �@qPCR増幅産物のシークエンスを確認して、目的のモノが増えているか確認する（コンタミしたものを検出しているだけかもしれない？） �Aプライマーを変えてみる 　（仮にテンプレートを今のやり方のままとすると、qPCRとプライマーを変える必要がありますでしょうか） といった対応でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4883-11 - 2016/02/29 (月) 15:38:14 - seventh 定量性を確認するために既知のサンプルの希釈系列を使われているようですが、PCRサンプルを使う場合吸着などの影響で低濃度だとかなりぶれます。 また、qPCRと同じプライマーをつかってのPCR産物よりは外側のプライマーやそれをプラスミドに入れたもののほうが安定します。 今回の場合はcDNAプールのサンプル（添加濃度を変えていると言われてますがどのぐらいの範囲ですかね？）を使ってもCt20で頭打ちとのことなのでqPCRのプライマーを再設計したほうがよいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4883-10 - 2016/02/29 (月) 15:15:17 - green >[Re:7] greenさんは書きました : > 絶対定量するわけではないのなら、ddCt法で比較してはいけないのですか？ 訂正 希釈してもCt値が変わらないのでしたね。 PCR産物のシークエンスを確認することを勧めます。

(無題) 削除/引用 No.4883-9 - 2016/02/29 (月) 15:01:29 - おお PCR産物を使っているので確かにコンタミはあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.4883-8 - 2016/02/29 (月) 14:59:42 - おお いろいろと返事が来てますが、そのまえに、１８、１９サイクル以降検量線が寝てきて、その状態で直線性があるとかないでしょうか。ようするの１８、１９サイクルまでは物が多すぎて何か違うものを見ているとか。検量線用のDNAはどれくらいの量いれてるのかな。んでもサンプルはいくら希釈してもCT値が２０ですか。。。

(無題) 削除/引用 No.4883-7 - 2016/02/29 (月) 14:58:51 - green >[Re:5] 困り中さんは書きました : > ＞検量線はなにを使ってますかプラスミドとかですか？ > 実際のサンプルから抽出したRNAからcDNAを作成し、PCRにて増幅後、PCR産物を段階希釈して検量線を作成しております この方法って一般的ではないと思うのですが。 一度PCRで増やした産物をさらにテンプレートに使う訳ですよね？ 絶対定量するわけではないのなら、ddCt法で比較してはいけないのですか？

(無題) 削除/引用 No.4883-6 - 2016/02/29 (月) 14:57:08 - TK-1 primerダイマーかコンタミ

(無題) 削除/引用 No.4883-5 - 2016/02/29 (月) 14:18:47 - 困り中 green様 分かりにくい文章で申し訳ありません。ＰＣＲ初心者のため、回答が間違っておりましたらご指摘ください。 。 ＞Ct値が低すぎるということは、発現が強すぎるということですよね。 ひとまず、サンプルの希釈系列を作ってみてはどうでしょうか。 検量線を作成しているのですが、ＣＴ値が１９あたりから検量線がねてきま す。したがってＣＴ値１９以降はきちんと定量できていないと考えています。 そして、実際のサンプルのＣＴ値は２０前後のため、定量できていないと判断しております。 私のイメージではｑＰＣＲではＣＴ値３５くらいまでは定量できるものかと思っていたので、こんなに早いサイクル数から定量できないのは何かおかしいのではないか？と思い、質問いたしました（意味が伝わりますでしょうか） ＞PCR後のバンドを確認したのは、qPCRと同じプライマーですか？ 同じプライマーです。 ＞melting curveのピークは一つでしょうか。 ピークはほぼ一つで、毎回同じです。 おお様 ＞しっかりかかっているようにみえるけど、プライマーダイマーが増えていてそれがきれいなシングルバンドに見えているってことはないでしょうか？ 申しわけありませんが、それはどのようにして確認すればよろしいのでしょか。一応プライマーは同じ細胞を使った論文で使用されていたものを使っています。 ＞検量線はなにを使ってますかプラスミドとかですか？ 実際のサンプルから抽出したRNAからcDNAを作成し、PCRにて増幅後、PCR産物を段階希釈して検量線を作成しております お伝えし忘れておりましたが、ポジコンを添加した場合はCT値がきちんと検量線の範囲内に収まり定量できております。

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