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(無題) 削除/引用 No.4881-5 - 2016/02/28 (日) 07:42:39 - A APさん 度々ありがとうございます。 rRNAはCGCGACC...で始まり、目的RNAの切れて失われた部分はTTCGCGCTC...という配列だったので、TTが無視されてrRNAのフラグメントがプライマーとして使われた、って可能性は確かになくはなさそうです。 まぁ全然面白くない単なるartificialなものということで若干がっかりですが、一応そんな感じで説明がつくというか納得はできる感じなのですっきりしました。 アドバイスどうもありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.4881-4 - 2016/02/27 (土) 15:33:07 - AP PCRプライマーでも。ホモロジーのあまりない配列からプライミングしてしまうこともあるのだから。 標的mRNAに対してrRNAの量は非常に過剰だったでしょうから、プライマー過剰に似てミスプライミングが起こりやすい状況だったと想像します。

(無題) 削除/引用 No.4881-3 - 2016/02/27 (土) 13:39:20 - A APさん 早速ありがとうございます。まぁそういうartificialな何かなんだろうな、って気がしますが、目的遺伝子のぶち切れた部分とrRNAの5'付近とで全く相同性がないんですが、overlap extensionは起こるものなんですかね…？

(無題) 削除/引用 No.4881-2 - 2016/02/27 (土) 13:05:11 - AP 意図せず起こったoverlap extension PCR

逆転写PCRで、2つの遺伝子が融合したものが増幅 削除/引用 No.4881-1 - 2016/02/27 (土) 12:47:54 - A リボソームフラクションからRNAを抽出し、オリゴdTで逆転写後、目的の遺伝子のForwardプライマーとオリゴdTでPCRし、スメアバンドを切り出し→クローニングしてシークエンスを読みました。 無事目的の遺伝子は得られたんですが、クローニング後の制限酵素処理でそれよりも少し長い断片が得られたクローンも配列を読んでみた所、目的遺伝子の150塩基目(全長は170 nts)辺りから突然ribosomal RNAの配列が60塩基ほど続いており、その後ポリAがついている、という奇妙な産物が得られて戸惑っています。 ここで得られたrRNA配列の終わり付近はAがかなり連続したプリンリッチな配列で、オリゴdTで逆転写がかかったのはそこが原因なのかな、って気がしますが、目的遺伝子とrRNAがひとつながりになってるのが、何が起きてこんなのが生まれたのか全く予想だにつきません。 どなたか何か原因を推察する取っ掛かり的なアドバイスが浮かぶ方いらっしゃいましたら、ご教示いただけると大変ありがたいです。よろしくお願いします。

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