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(無題) 削除/引用 No.4880-11 - 2016/03/01 (火) 09:08:57 - TK-1 GFPでラベルしたいだけならCFSE使えない？ それかマウスならBM progenitorにいれてT cellを回収するとか、GFP-tgなんか使えないもんなんですか？

(無題) 削除/引用 No.4880-10 - 2016/03/01 (火) 04:16:02 - Houston Lさんの仰る通り、増殖しない条件なので、レトロウイルスは不可でした。 今までがん細胞でやる限りはGFPをレンチで発現させても全然問題なかったのですが、やはりプライマリーだと毒性が問題になるのかもしれませんね。 EGFPでなくても良いのですが、きっとその場合はRFPとかにしても一緒ですよね？

(無題) 削除/引用 No.4880-9 - 2016/02/29 (月) 04:46:33 - L すいません。導入効率３０％というのを見落としていました。３０％しか入らない条件だと、GFP陽性細胞のほとんどがシングルコピーで感染していると思うので、MOIを下げても解決しない可能性が高いですね。GFPの毒性の可能性を考えて発現を下げるには、レンチベクターのプロモーターを変える必要があり、ちょっと面倒ですね。

(無題) 削除/引用 No.4880-8 - 2016/02/29 (月) 04:23:47 - L プライマリーのT細胞でウイルス感染実験をした事はないのですが、T細胞が増殖しない普通の培養条件でレトロはちょっと難しい気がします。もしアデノウイルスの受容体をT細胞が発現していれば、アデノウイルスでも行けるかもしれません。 線繊芽細胞に、通常のトランスフェクションでGFP融合たんぱく（GFP単独ではありません）を過剰発現して、ライブイメージングで見た事があるのですが、GFP強陽性の細胞からどんどん死んでいきました。この時は、GFPそのものではなく、融合したたんぱくの過剰発現のせいで細胞が死んでいくと考えたのですが、ひょっとするとGFPそのものの毒性だったのかもしれないと、このトピックを見ていて思いました。この実験ではGFP弱陽性の細胞は生き残り、発現量が低げれば何とかなるという結論でした。レンチの場合は、MOIが高いとマルチコピーでインテグレートして高発現になるので、MOIを下げて発現量をコントロールできるのであれば（かつ低発現でもソートに支障がないのであれば）一回試してみてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4880-7 - 2016/02/28 (日) 10:39:10 - おお ちょっと気になってるんですが、GFPの毒性って扱っている細胞でどの程度なんでしょうかね。。。

(無題) 削除/引用 No.4880-6 - 2016/02/28 (日) 09:21:37 - TK-1 retroで出来ない理由がないのならretroでやればいいんじゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.4880-5 - 2016/02/28 (日) 01:17:09 - Houston それはレンチウイルス感染そのものによる毒性という風に考えれば良いでしょうか？その場合はGFP導入方法をレンチ以外に方法に変えるしかないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4880-4 - 2016/02/27 (土) 12:42:29 - TK-1 CD4 T細胞ですか？よく死にます。CD8はそれほどでもないです。

(無題) 削除/引用 No.4880-3 - 2016/02/27 (土) 11:48:57 - Houston マウスです。

(無題) 削除/引用 No.4880-2 - 2016/02/27 (土) 06:25:50 - TK-1 T cells from mouse or human?

レンチウイルスの毒性？？ 削除/引用 No.4880-1 - 2016/02/27 (土) 04:46:07 - Houston 現在レンチウイルスを使ってプライマリーのT細胞にEGFPを発現するプラスミドを導入しています。導入24時間後に30%のGFP+細胞がありGFP+ or GFP-の細胞を其々FACSでsortしてcultureすると、更に24時間後にはなぜかGFP+細胞だけ全て死んでしまいました。このプラスミドはGFP以外に何も入っておらず、抗生剤によるセレクションなども行っておりません。MOIは20程度で感染させています。 このウイルスに何か毒性があるのかと疑い、このウイルスをHEK293細胞に感染させましたが、しっかりGFP+細胞が得られて、何も問題は起こりませんでした。 どなたかなぜGFP+細胞だけが死んでしまうのか、原因がわかる方がおられますでしょうか？

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