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(無題) 削除/引用 No.4856-12 - 2016/02/20 (土) 06:00:08 - mon もしかしてCO2インキュベーターが故障していて、CO2濃度が設定値に達していないとか？？？ でもExpiCHO-S細胞は増えるのですよね〜。293よりCHOの方がストレスに強いけど。。

(無題) 削除/引用 No.4856-11 - 2016/02/20 (土) 01:45:17 - Expi293 monさん、さくさん、 いろいろと有用な情報ありがとうございます。 早速いま培養しているExpi293に8mM Glutamineを加えてみました。 ただ、細胞が増えなかったときに別ロットの新しいMediumに変えてみたことがあるのですが、それでも問題が解決されなかったです。 とりあえず、様子見て、それでもだめな別の細胞を会社にお願いしてみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4856-10 - 2016/02/19 (金) 09:42:45 - mon Expi293細胞が増えない理由は、培地にありそうですね。。。GlutaMAXが含まれていないとか？メーカーに事情・ロット番号を話して新しい培地をサンプルを依頼してはいかがでしょうか。 FreeStyle-CHO-S細胞もExpiCHO-S細胞も扱っていますが、コンフルエント近くまで増えると壁面に横筋になってくっつきますね。ExpiCHO-S細胞の方が培地成分のおかげか細胞塊になりづらいような感じですけど。どちらも植え継ぐときに充分に細胞をほぐさないと凝集しやすく壁面にも付きやすいです。FreeStyle-CHO-S細胞のときは、培養途中で壁面の細胞をピペットの腹でなでつけ剥がし、培地に沈んでいる細胞塊をピペッティング（フラスコ底にピペット先を押しつける感じ）でバラしていましたが、面倒でしたね。。トリプシン処理って細胞塊バラすのに効果あるのかな？？こんどやってみるか。。 別の浮遊用CHO培地ではPlutonic F68が0.3%含まれているものがありましたので、0.2％分増量してみるのも良いかも？

(無題) 削除/引用 No.4856-9 - 2016/02/19 (金) 09:37:33 - さく ご質問の主旨からは外れますしExpiCHOは使ったことありませんが、CHO-Sなら使ったことがあります。 もし「壁面に付く」と言われているのが10〜14日程度の長期培養の際のことでしたら、それが普通です。あまりに大量に壁面につくので、初めて培養したときは驚きました。だいたい増殖のピーク〜生存率が下がってくるあたりまで培養するので、培養後半は死細胞が増える、死細胞が崩れてゴミが増える、生きていてもアグる…とカウントしにくくて往生していました。壁面のは下手に触って培養液中に落としたりするより、そのままにして培養した方が良いと教わりました。 3〜4日継代の場合でも少し付着は見られますが、コーニングの三角フラスコでは目立つほどでは無かったです。

(無題) 削除/引用 No.4856-8 - 2016/02/19 (金) 08:54:20 - Expi293 monさん、 いろいろとご指摘ありがとうございます。 Flaskは新しいのを使用しています。 いろいろと試しているのですが、どれもうまくいっていません。 以前FlaskをShakerからとって、静置培養も試してみました。 Kitには2つしかVialがなかったため、試行錯誤で使い果たし、別のものを購入したのですが、それでも増えません。 同時にExpiCHOも購入したのですが、こちらは増えます。がすぐに細胞同士がアグリます。 またさくさんが言うようにFlaskの壁にその細胞が引っ付いてしまいます。 これはこれで問題になっていて、頭が痛いです。

(無題) 削除/引用 No.4856-7 - 2016/02/18 (木) 18:04:50 - さく mon様 ご教授頂き、ありがとうございました。 多少手間がかかろうとも、条件を振ったりする時には数が必要になってきて費用的に大変助かるので、私のところでも是非やってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4856-6 - 2016/02/18 (木) 17:34:06 - mon > DDWを口までめいっぱい入れてオートクレーブする理由は何でしょうか？ 細胞に悪さする何か（残留洗剤？Endotoxin？）を出来るだけ減らす意味で行っています。通常の洗浄(MilliQ水でのすすぎも含む）＋滅菌目的のオートクレーブでは、たまに細胞の増えが悪いときがあったためです。熱いうちに捨ててMiliiQ水ですすいで、再度オートクレーブ後乾燥させています。念のため廃棄物・大腸菌用培地の滅菌を行わない（きれいな？）オートクレーブ機器を使っています。 > DDWを入れてオートクレーブする時、蓋は軽く乗せるような感じでしょうか？ ゆるめに締めています。カパカパと動くくらいですが外れないくらいで、オートクレーブテープで留めています。DDWはオートクレーブ後（あふれて？）減ります。 > 何回ぐらい洗ってお使いでしょうか？ 5回以上は使っていますが、見た目（ポリカーボネート表面や傷）が汚くなったら捨てています。もともとdispoだし。多少は細胞が壁面に張り付きやすくはなりますので、張り付きが酷くなったものも捨てています。 大腸菌用に使っているバッフル付きのものは通常の洗浄のみで20回以上（割れる迄？）再利用しています。

(無題) 削除/引用 No.4856-3 - 2016/02/18 (木) 14:11:32 - さく 横からで申し訳ありません。monさんのコメントで、よろしければ追加で教えて頂きたいことがあります。 私もコーニングのポリカーボネート製ベントキャップ三角フラスコを使っています。高価なので、継代するだけの時は2〜3回使い回していたのですが、回数を重ねるごとに壁に細胞が張り付いてしまい、結果、死細胞の割合が増えたりダマダマになったりします。 フラスコを洗浄出来るならありがたいのですが、DDWを口までめいっぱい入れてオートクレーブする理由は何でしょうか？DDWを入れてオートクレーブする時、蓋は軽く乗せるような感じでしょうか？また、何回ぐらい洗ってお使いでしょうか？ 申し訳ありませんがよろしくお願い致します。 Expi293は使った事ありませんが、もし輸送中にトラブルが発生していた場合は全く増えない可能性はあります。私なら静置培養してみてそれでもダメならメーカーに連絡します。 細胞培養をよくされているのであれば大丈夫と思いますが、三角フラスコにバッフル付いてないですよね？バッフルでストレスかかっても増えない事は無いような気がしますが一応…。

(無題) 削除/引用 No.4856-2 - 2016/02/18 (木) 09:33:15 - mon 良く増える細胞だと思いますが、コンタミが原因でないとすると、 ロットが悪い（メーカーのクレームを入れると別ロットを送ってくれると思います）、 回転数を落とす、無処理dish（大腸菌用でOK：接着細胞用でも張り付かないのでOK)やフラスコでの静置培養を試す、かな。 またShaking flaskは新品ですか。再利用しているなら汚れ（洗剤残り）かEndotoxin等の問題かも。 ウチではコーニング製のキャップフィルター付きポリカーボネート製を使っています。最初のストック作製までは新品を使いますが、dispoで使えるほど裕福ではないので、通常の洗いの後、DDWを目一杯いれてオートクレーブ。熱いうちにDDWを捨てて再度オートクレーブし乾燥させて使っています。クリーンベンチ内でDDWを廃棄すれば二回目のオートクレーブは不要です。

Expi293の培養でのトラブル 削除/引用 No.4856-1 - 2016/02/17 (水) 21:28:18 - Expi293 現在Life technologiesから初めてExpi293のキットを購入して培養を始めたものですが、まったく増えずに困っています。 キットの購入ですので、培地も指定のものを使って、培養条件もまったくプロトコール通りにしているにもかかわらず、細胞がどんどん死んでいきます。 培養条件は8%CO2,Shaking flask (125rpm)、1 vial/30ml medium。 周りに聞いたところ、初めの細胞密度が低いんじゃないって言われて、培地量を減らして培養したのですが、同じでした。 また、2% FBSを初めに加えてみたらといわれたのですが、これも効果がなかったです。 多くの人が使っていると思うのですが、なぜ自分のところでこんなに問題になっているのかがわかりません。 経験のあるかたがいらしたら、ぜひご指導お願いいたします。

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