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(無題) 削除/引用 No.4848-10 - 2017/05/19 (金) 12:34:25 - エヴァんす その後改善されましたか？ 抽出後の見た目はどうでしょう？ 小生の経験では抽出後の見た目に差があっても、ODを測ると差がないこともありました。抽出後のホルムアミドによけいな組織が残っていたからではないかと考えていましたが、どうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4848-9 - 2016/02/20 (土) 10:23:05 - K 以前、皮膚と肺の血管透過性をエバンスブルーで評価していました。 皮膚の場合はPBS潅流は行っていません（行っても問題ないと思いますが）。目的部位を大体1cm2程度切り取り、ハサミで細かくミンスしたのち1mlのホルムアミドにいれて56℃でO/Nしてました。肺はPBS潅流してから取り出し同じようにミンスしたのち抽出しました。なおいずれも組織の乾燥はやっていませんでした。 コメントを見る限り、目で見て明らかに青いのに差が出ないというのは、ホルムアミド中への抽出効率が悪い？ような印象を受けましたので、組織をよくミンスするか軽く破砕してみてはどうでしょうか？あとは組織量と加えるホルムアミドの比を変えてみるとか？

(無題) 削除/引用 No.4848-8 - 2016/02/18 (木) 13:22:24 - エバンス 何度もすみません。 ttp://corning-ls.jp/faq/pdf/v91svb0000002tmg-att/v91svb0000002tql.pdf#search='エバンスブルー+血管' 組織を摘出する前に2 mM EDTA を含 む PBSで還流しているようですね。うちでもそうしているとおもいます。ただ、彼がするようにヘモグロビンの吸光を補正するというのは検索しても見つかりませんでした。 組織を摘出して、ホルムアミドに一晩漬けてエバンスブルー色素をホルムアミド中に拡散させるようですが、温度も37度、二日間や、65度一晩、などいろいろです。経験をお持ちの方がいらっしゃいましたらぜひコメントをいただけますと幸いに存じます。どうか、よろしくお願いいたします。

遅れてすみません。 削除/引用 No.4848-7 - 2016/02/17 (水) 13:05:10 - エバンス おおさま、まっくろん様、たていす様、コメントいただきありがとうございます。 実は私の同僚（外国の方）の実験でして、本人が数週間も困っており、ボスからも叱責されてるのをみて、何か力になれればとこちらで質問させていただきました。本人から詳しい抽出方法を聞きましたので、どうかよろしくお願い致します。 1. まず、マウスの開腹後、目的の組織（脳、肺、胸腺？、肝臓、腎臓、脾臓、皮膚、小腸）を取り出し、一つの組織につき、３つのピースをカットし、秤量します。例えば腎臓なら３等分にして重さを測る（wet weight）。小腸は長すぎるので適当な文節で３つのピースをカットして得ます。 2. その後、65℃のオーブンで一晩、組織を乾燥させ、それで得られたdry tissuesを秤量し（dry weight）、そこへ500 ulのホルムアミドを各組織に加え（同じ組織量かどうかは聞き忘れました・・）、60℃で24時間Evans Blueをホルムアミド中にextravasateさせます。 3. その後、よく転倒混和して、その上清100 ulを96 well plateに入れ、OD620およびOD740を測定します。 彼曰く、肝臓および腎臓はbloodyとのことでこれら組織のみヘモグロビンの補正（OD740, ヘモグロビンそのものの色素を除外するため）を以下の計算式で補正しているようです。 Values were corrected for hemoglobin (OD620-(1.426*OD740+0.03)). 既知の濃度のエバンスブルー試薬で検量線を作成して、そこから組織にextravasateしたエバンスブルーの量を求めているようです。 彼はマウスにPBSを還流するべきなのか、それともマウスを安楽死をさせて組織を採っていいのかわからず困っているようです。 もしみなさまの中でご経験ありましたら、ぜひご教授いただけますと幸いに存じます。 どうぞよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4848-6 - 2016/02/16 (火) 14:28:34 - たていす ご経験はございません。 ＞組織内に漏出したエバンスブルーをOD220で測定しています。 と、簡単に言っているけれど、そうできていないのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.4848-5 - 2016/02/16 (火) 11:31:04 - まっくろん 私も具体的な手法を書いたほうが、意見をもらえるのではないかと思います。 組織内のエバンスブルーは何かの溶液に溶出させて測定してるんですかね？どこの組織かは忘れましたが、ホルムアミドに溶出させて測定している論文を見たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.4848-4 - 2016/02/16 (火) 10:37:40 - おお >ただ、OD220で組織内エバンスブルーを測定すると、LPS有無で差がないデータがでます。 顕微鏡下では明らかな差を認めるにも関わらず測定が思い通りいかず困っています。 具体的にどうやって測定したのか書いてないので、測定の仕方が悪かったかもねとぐらいしかかけませんけど。。。

(無題) 削除/引用 No.4848-3 - 2016/02/16 (火) 09:43:20 - エバンス たていす様、誤植のご指摘ありがとうございます。 ご指摘の通り、620ナノメートルです。 たていす様がもしご経験ありましたら、以下のことのうち、お分かりになるところのみコメントいただけないでしょうか？ エバンスブルー投与後にPBSの還流は必要か、また、４％PFAの還流も併せて行うべきでしょうか？ 組織中の水は測定に邪魔になりますか？ドライの組織を用いるべきでしょうか？ ご協力を感謝いたします。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.4848-2 - 2016/02/16 (火) 08:56:42 - たていす ＞OD220 620nmではなくて？？

血管透過性アッセイ（エバンスブルー）がマクロと一致しない 削除/引用 No.4848-1 - 2016/02/16 (火) 08:35:06 - エバンス 今、野生型マウスにPBSもしくはLPSを腹腔内投与したマウスにエバンスブルーを静脈内投与し、その後マウスの心臓からPBSを還流させ血管内のエバンスブルーを除いた後、組織内に漏出したエバンスブルーをOD220で測定しています。補正は組織の重量で行っています。LPSは血管透過性をあげるためのポジコンとして使っています。実際LPSを投与されたマウスではだるそうにしていますので、しっかりLPSは効いていそうです。 質問は、肺や肝臓、脾臓や腎臓はLPS投与群の方で圧倒的に青く染まっているのが目視でもわかります。脳ですらより真っ青になります。 ただ、OD220で組織内エバンスブルーを測定すると、LPS有無で差がないデータがでます。 顕微鏡下では明らかな差を認めるにも関わらず測定が思い通りいかず困っています。 ご経験がおありの方がいらっしゃいましたら、テクニック等シェアしていただけますと幸いに存じます。どうぞ宜しくお願い致します。

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