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(無題) 削除/引用 No.4840-3 - 2016/02/13 (土) 13:40:45 - toto 合成DNAを複数つなぐときにうまく行かないときは、それぞれの合成フラグメントをPCRして端を揃えてつなぎ直すようにしています。どういうケミストリーで合成しているのかよく知らないのですが、設計配列の末端に余計な配列が付加されることがあるからではと思ってます。確かめた事は無いですが。 以前のトピックでNEB BuilderとGibsonの比較の話を書きましたが、メーカーの宣伝文句にあるとおりに、NEBBuilderのほうが、複数フラグメントをつなぐ場合には、Gibsonよりも優れている結果は得ています。ただ、単純に一フラグメントをベクターにつなぐ場合は、GibsonのほうがBuilderよりも効率という点では数倍高いようです。いずれにしても、生えなくて困るという方法では無いので、どちらでも問題はないのですが。

(無題) 削除/引用 No.4840-2 - 2016/02/12 (金) 19:52:13 - ウイルスや いつも5 fragmentとかやっています。 あまり変わったことはしていないと思いますが、15 bp overlapでしょうか？ 変更する点があるとすれば、もう少し全体の核酸量を少なくしたほうがいいかもしれません。全部で、0.2 pmolとかに。 それでもダメなら、Gibson assemblyとかNEBuilderの方がおすすめですよ。私は、In-fusionでうまくいかなかったものがGibsonでうまくいった経験があります。 そもそも配列がletalであったら元も子もないですが。。

複数断片In Fusion 削除/引用 No.4840-1 - 2016/02/12 (金) 18:18:06 - 海人 お世話になります。 複数断片でのIn Fusionについてご助言お願いします。 現在、In-Fusionにて8Kのvectorに各1Kのfragmentを2断片を導入試みております。 各fragmentは外注で人工合成し、In-Fusion試薬はTakara、コンピテントセルはHST08を使用していますが、なかなか目的の産物を得ることができません。 vectorが200ngに対して各fragmentを100ngずつ反応させています。 複数断片In-Fusionについてご経験がある方、ご指導いただけると大変助かります。

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