seventhさん、お返事ありがとうございます。
> 原理的なことを言えば対象の遺伝子のmRNA量とCtがリニアに相関するようなスレッシュホルドを設定すれば良いので遺伝子毎にスレッシュホルドが違っても問題ありません。
同一プレート内でのサンプル間比較については、おっしゃるように遺伝子ごとにシュレッシュホルドが違っていても比較可能と理解しているつもりなのですが、プレートの異なるサンプル同士を比較しようとした場合、それぞれの遺伝子ごとのスレッシュホルドが違ってしまうとデルタCT（CTtarget-CTgapdh）の値が変わってきてしまうことを心配しています。
現状では、機器の自動設定されているスレッシュホルドは、同一プレート内でも遺伝子ごとに異なっており、さらに異なるプレート間の同一遺伝子のスレッシュホルドも異なっているため、ちょっと自分自身も混乱しています。
> 質問内容とは異なりますが、ターゲットを2つに分けてGAPDHを両方のプレートで測れば良いのでは？
説明が不十分ですみません。
現在様々な感染条件下でマウスからのサンプリングをしているため、サンプル総数は50を超えています。そのため、プレート間比較は避けられないような状況なんです。
おおさんもお返事ありがとうございます。
> 何かスタンダードになるものを両方のプレートにのせておけばいいだけの話だと思いますが、、、
確かにおっしゃることはその通りなのですが、そのスタンダードになる遺伝子の設定も、スレッシュホルドの値でCT値が変化してしまうと思います。
質問をもう一度整理しますと、
1.デルタデルタCT法で相対比較を行う場合、同一プレート内の複数の遺伝子で同一のスレッシュホルドを設定する必要があるか？
2.同様の条件で複数枚のプレートで解析を行う場合、異なるプレート間における同一遺伝子のスレッシュホルドは同一にする必要があるか？
以上の2点をお聞きできればと思いご質問させていただきました。
説明があまりうまくできずすみません。
1．に関してはseventhさんのお答えにもあるように、必ずしも同一のスレッシュホルドでなくても解析可能（同一のスレッシュホルドに設定することも特に問題はない）と解釈させていただきました。
現在、1.2．を同時に満たしたいような実験を行っているため、最もリーズナブルな方法としては、すべてのスレッシュホルドを一定値に固定してしまうというのがいいのかなと考えている次第です。
またご意見などいただけましたら大変ありがたいです。 |
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