BioTechnicalフォーラム [細胞死が誘導されなくなった]

細胞死が誘導されなくなった

No.4831-TOPIC - 2016/02/08 (月) 21:31:04 - つちのこ

培養癌細胞に、ある脂質を作用させて細胞死を誘導するという実験を行っています。
私の研究室で5年ほど前から続くテーマなのですが、半年ほど前から突然再現性が取れなくなってしまいました。このように突然再現性が取れなくなった経験のある方はいらっしゃいますか？
テーマの研究を始めた頃のプロトコールと変えた部分はありません。しかし条件を変えてみたら細胞死が誘導されるようになるかもと思い、細胞を起こしなおしたり、培地や血清濃度を変えてみたり、細胞死を誘導するのに用いている脂質を新しくしてみたり、いろいろな条件でも試してみたのですが…さっぱり細胞死が起きないのです。
細胞死が誘導されなくなった原因がわからないため、実験が進まなくなってしまいました。何か原因として考えられることはあるでしょうか？
癌細胞にはラット腹水肝癌細胞のAHを用いています。以前はHepG2においても同様に細胞死が誘導されていたのですが、こちらも突然死ななくなってしまったと聞いています。
　

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No.4831-8 - 2016/02/11 (木) 11:40:53 - mbb

結構単純な見落としがあるかもしれません。
たとえばマイクロとピコの間でナノを忘れて
計算しているとか、たまに学生さんでそういう
ミスをする人がいました。実験プロトコルを
複数人で読み合わせすると、こういうミスは
防げることが多いように思います。

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No.4831-7 - 2016/02/10 (水) 18:36:22 - 元アポトーシス屋

死ななくなったと判断されている根拠は何でしょうか。
例えば cleaved caspase3 抗体があたらないということですか？
ポリクロ抗体はロットによって驚くほど力価に差がある事があります。全くシグナルが出なくなった抗体の例を２つ知っています。
（ただしこの製品を疑う意図はありません。あくまで可能性の話です。）

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No.4831-6 - 2016/02/09 (火) 10:45:52 - つちのこ

>aaさん
ご返信ありがとうございます。
最初に死ななくなった時期の前後で試薬や血清のロットを変えていませんでした。ただし、培地の作成や血清の非働化は研究室で行っているので、その時によって微妙に状態が異なるのかもしれません。
他にも何か要因があるか、もう一度確認してみようと思います。

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No.4831-5 - 2016/02/09 (火) 10:25:04 - つちのこ

>おおさん
ご返信ありがとうございます。
脂質添加の際に、BSAなどは用いていません。
両親媒性の脂質なので、以下のように調整しています。
無血清培地に一定の濃度になるように溶かす
→50度で15分加熱
→30分超音波処理によってミセル化
→実験培地に5または10μg/mlとなるように添加

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No.4831-4 - 2016/02/09 (火) 07:49:19 - aa

うまくできなくなった前後でかわったことがあるはずなので、それを調べるべきだと思います。
血清や試薬を新しく購入したとか、調製し直したとか。
メーカーが違うと活性が異なることはよくありますし、同じメーカーでもロットが違うだけでも結果に影響することがあります。