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CRISPR/Cas9 レポーターKnock-in ベクターの設計 トピック削除
No.4811-TOPIC - 2016/02/03 (水) 08:19:36 - KtR
いつも参考にさせていただいております。
knock-inベクターの設計で悩んでおりますので、
知恵をお貸しください。

これまで1stATG直下をヘテロでそのまま置き換える形で
レポーターKnock-in株をいくつか作ってきましたが、
今回の標的遺伝子はATG上流250bp程度のところに
CTリピートが存在し、5’アームのクローニングや人工遺伝子合成が困難です。
現在考えているベクターの設計としては、

@5'側 250bp + 3'側 1000bpでアームを作成する。
A250bp+ATG下流の250bpまでクローニングして、
　レポーター遺伝子のN末に標的遺伝子由来の配列をつくようにする
BCDS部分の配列をアームにして、標的遺伝子-2A配列-レポーター
　という設計にする
C標的遺伝子のC末に融合させる

なのですが、どの方法が適切でしょうか。
あるいは、ほかのコンストラクトの例がございましたら
教えていただけるとありがたいです。
よろしくお願いします。
　
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CRISPR/Cas9 レポーターKnock-in ベクターの設計 削除/引用
No.4811-1 - 2016/02/03 (水) 08:19:36 - KtR
いつも参考にさせていただいております。
knock-inベクターの設計で悩んでおりますので、
知恵をお貸しください。

これまで1stATG直下をヘテロでそのまま置き換える形で
レポーターKnock-in株をいくつか作ってきましたが、
今回の標的遺伝子はATG上流250bp程度のところに
CTリピートが存在し、5’アームのクローニングや人工遺伝子合成が困難です。
現在考えているベクターの設計としては、

@5'側 250bp + 3'側 1000bpでアームを作成する。
A250bp+ATG下流の250bpまでクローニングして、
　レポーター遺伝子のN末に標的遺伝子由来の配列をつくようにする
BCDS部分の配列をアームにして、標的遺伝子-2A配列-レポーター
　という設計にする
C標的遺伝子のC末に融合させる

なのですが、どの方法が適切でしょうか。
あるいは、ほかのコンストラクトの例がございましたら
教えていただけるとありがたいです。
よろしくお願いします。
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