BioTechnicalフォーラム [大腸菌中での2nd, 3rd　以降のATGは開始コドンになるか？]

大腸菌中での2nd, 3rd　以降のATGは開始コドンになるか？

No.4808-TOPIC - 2016/02/02 (火) 18:26:43 - atg

こちらのフォーラム、いつも参考にしております。

現在ポリクロ―ナル抗体の作成を行おうと、大腸菌発現系でC末 6xHisタグ付きの抗原タンパクを作成しております。
この精製過程でのトラブルについてのトピックになります。

ニッケルレジンでの精製と透析も終わり、さあ精製できたかなとSDS-PAGEを行ったところ、目的タンパクは巨大なバンドとして出てきてくれたのですが、それより小さいサイズの、サブバンドがかなり出てきてしまいました。

それどころか設計したタンパクのサイズに非常に近い、強いバンドまでも現れてしまい、一体これはなんだろうか？と悩んでいる状態です。

使っているレジンのマニュアルに「サブバンドがあるときはほかの翻訳開始点があるかもしれない」みたいなことが書いてあったので、目的タンパクの塩基配列を見ました。
すると、かなりの数のin frameなATGがあり、その近傍にShine-Dalgarno配列の最低単位であるAGGがあることも少なくないです。
AGGAGGといったかなりShine-Dalgarno配列に近いものも存在します。

試しにソフトウェア上でin frameなATGから翻訳させてみると、サブバンドの大きさに近い分子量がはじき出されてきます。

まだウェスタンでの6xHisタグの検出は行っていませんが、メインバンドより上のサイズのタンパクはほとんどない状態で、サブバンドに近いサイズのORFもありうることから、トピックのタイトルとさせていただきました。

実際にin frameのATGから短いタグ付きタンパクがドバドバ出てきた、といったような経験が合った方がいましたらアドバイスお願いいたします。

他、精製条件など、ヒントになりそうなことを書いておきます。
・タンパクの可溶化は6Mのグアニジンで、レジンに結合した状態での洗浄はpH=6.3で４度ほど行っております。溶出はpH=4で二回。

・菌株はRosetta-gami2

・タンパクに関しては抗原として出せればいいや、ということで結構アグった状態で流しており、これ以上の精製に関しては再度のニッケルレジンかコバルトレジンでの精製かな？と思っているくらい。

・PBSでの透析や限外濾過でどうやってもアグる。DTTも試したし、等電点から大分離れたバッファで透析を行っている。

以上、お願いいたします。
　

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No.4808-5 - 2016/02/02 (火) 22:57:25 - おお

6xHisによる精製は結構夾雑物がまじります。短いあなたの蛋白（ちがうATG、切断など）に加えてある程度大腸菌由来のものもあると思います。6Mのグアニジン存在下でもいいからゲルろ過とかでサイズで更に精製するか、尿素か界面活性剤存在下でイオン交換などで精製すればかなりきれいになると思います。

アグっていると言っても、6Mのグアニジンを使っていればほぼ完全な一本のポリペプチドとして精製されていると思います。

抗原タンパク精製にアルギニンは使えるか？

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No.4808-4 - 2016/02/02 (火) 20:03:17 - atg

monさん
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>大腸菌中での2nd, 3rd以降のATGは開始コドンになるか？
なります。特に過剰発現でSD様配列があればなおのこと。
C末にHisタグがついているのでしょうか？N末に付けるのも解決策になるかも。
抗原にするだけならSDS－PAGEゲルを切り出せば目的は達成できるし、in-frameなら短くても問題ないかも。
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心強い断言ありがとうございます。
なんにせよこの場合ではウェスタンでの確認が最優先ですね。

APさん
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>その段階でも確認できるなら二次的な翻訳開始の可能性がありますが、その段階ではインタクトで、精製過程で切断が起こっているかもしれません。両方起こりえます。
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切断のことをすっかり忘れていました。
一応、スモールスケールでの系ではIPTG誘導後に増えてくるバンドが複数あって「おかしいな？」と思うことはあったのですが、ライセートと一緒に流すということは忘れていました。
次の泳動でやってみようと思います。
二次的な翻訳開始と切断両方おこっているか、ウェスタンで確認を急ぎます。

(無題)

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No.4808-3 - 2016/02/02 (火) 19:19:40 - AP

>ニッケルレジンでの精製と透析も終わり、さあ精製できたかなとSDS-PAGEを行ったところ、目的タンパクは巨大なバンドとして出てきてくれたのですが、それより小さいサイズの、サブバンドがかなり出てきてしまいました。

精製前のwhole lysateのSDS-PAGEは見ていないのですか？
その段階でも確認できるなら二次的な翻訳開始の可能性がありますが、その段階ではインタクトで、精製過程で切断が起こっているかもしれません。両方起こりえます。

(無題)

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No.4808-2 - 2016/02/02 (火) 18:54:24 - mon

>大腸菌中での2nd, 3rd以降のATGは開始コドンになるか？
なります。特に過剰発現でSD様配列があればなおのこと。
C末にHisタグがついているのでしょうか？N末に付けるのも解決策になるかも。
抗原にするだけならSDS－PAGEゲルを切り出せば目的は達成できるし、in-frameなら短くても問題ないかも。

大腸菌中での2nd, 3rd　以降のATGは開始コドンになるか？

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No.4808-1 - 2016/02/02 (火) 18:26:43 - atg

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