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poly-Lysineコートしたプレートのビオチン化 削除/引用 No.4807-10 - 2016/02/25 (木) 00:21:28 - はじめ 横からで済みません。このトピに関連するかもしれませんので、失礼します。 最近起こった事象として、poly-L-Lysineコートプレートで神経細胞を培養したときに、コンフルが60%（神経細胞なので細胞体＋突起部分込みで、細胞成分で覆われてない部分が30%-40%くらいあるとき）程度でビオチン化（primary amineをターゲットとしてビオチン化）をし、その後、アビジンビーズで回収したのですが、明らかに目的の膜分画の効率が落ちるようでした。 後のWBでのバンドが明らかに違いました（可能な限りほかの条件を揃えた上で）。 濃度も1mMくらいの高いビオチン濃度を使いましたが、結局は、cell lysisの際にビオチン化lysineも回収され、アビジンにそれらがくっついて、ビオチン化蛋白と競合しまうためかと考え、アビジンビーズの量を増やすと、改善したということがありました。 90%コンフル以上の接着細胞であれば、問題ないかともおもいますが、低い場合は要注意なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.4807-9 - 2016/02/04 (木) 12:30:58 - mbb >[Re:8] AAさんは書きました : > 標的のアミノ酸については、すみませんちょっとわからないです。 > たしか、ピアースかどこかのアミノ基に反応するビオチンを使っていたように > うっすら記憶しておりますが。。。 > ビオチン誘導体の官能基によって カルボキシル基とかチオールとか 標的が変わるので、使ってる試薬の マニュアルをちゃんと読んでもらう のが良いとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.4807-8 - 2016/02/03 (水) 19:40:39 - AA 標的のアミノ酸については、すみませんちょっとわからないです。 たしか、ピアースかどこかのアミノ基に反応するビオチンを使っていたように うっすら記憶しておりますが。。。

(無題) 削除/引用 No.4807-7 - 2016/02/03 (水) 17:40:32 - アミン 前にもどこかで書きましたが、BDのアミンコートディッシュ・プレートがいいです。293とかはトリプシン-EDTAでもはがれにくくなります。PBSでのWashにもかなり耐えてくれるのではと思います。

(無題) 削除/引用 No.4807-6 - 2016/02/03 (水) 16:20:14 - ミニミニ サンショウウオさん ご意見ありがとうございます。 実はcollagenコートは別の細胞でしかやったことがなく、HEKではいつもLysineコートだったので、大変参考になりました。 確かに、コンフルだったらロスも少ないはずですよね。 Lysineコートでビオチン化してみて、検出できなかったらcolllagenコートや浮遊状態でのビオチン化を試してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4807-5 - 2016/02/03 (水) 00:22:04 - サンショウウオ ポリDリジンで基盤もろとも細胞を標識してももんだいないのでは？ 80%コンフル以上なら、ロスも問題ないでしょう。 あと、コラーゲン基盤上でもHEKは剥がれやすい印象。

(無題) 削除/引用 No.4807-4 - 2016/02/02 (火) 19:14:06 - ミニミニ AAさん ご意見ありがとうございます。 ちなみにその知人の方が使用していたビオチンの標的はどのアミノ酸だったかご存知でしょうか？ 何にせよコーティングのアミノ酸はあまり気にしなくても問題ないということでしょうかね。。。 monさん > HEK293ならPBS（+EDTA)で剥がれますよね。。剥がした後回収し浮遊状態でビオチン化はダメですか？ ご意見ありがとうございます。 剥がしてチューブ内でビオチン化できれば、ロスも少なくビオチンの量も少なくて済むので私も検討していたのですが、いかんせん論文を読んでもdish上で行っているものばかりで…。 理論上はできそうな気がするのですが、方法的に認めてもらえるのか不安で二の足を踏んでいたところでした。。。

(無題) 削除/引用 No.4807-3 - 2016/02/02 (火) 19:05:05 - AA 自身の経験ではないので恐縮ですが、知人はコラーゲンコートで 膜上のタンパクのビオチン化標識を行ってました。

(無題) 削除/引用 No.4807-2 - 2016/02/02 (火) 18:59:30 - mon HEK293ならPBS（+EDTA)で剥がれますよね。。剥がした後回収し浮遊状態でビオチン化はダメですか？

ビオチン化の際のdishのコーティング 削除/引用 No.4807-1 - 2016/02/02 (火) 17:32:20 - ミニミニ いつも参考にさせて頂いております。 細胞のビオチン化についてですが、ビオチン化の手順の途中でdishから細胞がどんどん剥がれていってしまいます。 細胞がHEK293で剥がれやすいことと、Ca、Mg入りとはいえ冷やしたPBSで何度も洗浄するため、洗浄する度に剥がれる…といった感じです。 そこで、dishのコーディングをしようと思うのですが、現在ラボにはpoly-D-Lysineとcollagen type1しかありません。 ビオチンのターゲットがLysineということもあり、これらを用いてコーティングをしていいものか教えて頂きたいです。 poly-D-Lysineはビオチンのロスが多くなってしまう気がするのでダメかなと思ってますが、collagenもLysineを8つ持っているようです。 ご意見よろしくお願いします。

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