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(無題) 削除/引用 No.4797-9 - 2016/01/30 (土) 17:57:10 - おお In molecular biology, RNA 5'-triphosphatases (RTPases) are phosphatases that cleave the 5'-terminal γ-β phosphoanhydride bond of nascent messenger RNA molecules, thereby releasing a phosphate group. They generate 5'-diphosphate-ended mRNA from 5'-triphosphate-ended precursor mRNA molecules. https://en.wikipedia.org/wiki/RNA_triphosphatase どっかで製品化されていたようなきがするけど、、、ちょっと見つからんかった。

(無題) 削除/引用 No.4797-8 - 2016/01/30 (土) 17:23:28 - rna おお様 ありがとうございます。基本的な質問ですいませんでした。 少し不安だったもので。 少し思ったのですが、phosphataseで処理するとすべてのリン酸基が取れてしまうのなら、5'-pp RNAの状態にしたいときはどうすればよいのでしょうか？ どなたかご存知でしたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.4797-7 - 2016/01/30 (土) 17:19:41 - rna AP様 大変勉強になりました。 リン酸基やらピロリン酸やらモノエステルやらで少し混乱していましたので大変助かりました。 しかし、Pyrophosphataseなどいろいろ変わった酵素が売っているモノだと感心いたしました。（自分の無知がお恥ずかしいですが。。。） ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4797-6 - 2016/01/30 (土) 17:16:37 - おお RNA structure mapping and footprint assays RNA was synthesized using the Ambion T7 MEGAscript kit and PCR-generated templates. Gel-purified RNA was dephosphorylated with calf intestinal alkaline phosphatase and then 5′ end-labelled using T4 polynucleotide kinase (NEB) and [γ-32P]-ATP (7000 Ci mmol−1). RNA http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/mmi.12136/full

(無題) 削除/引用 No.4797-5 - 2016/01/30 (土) 17:10:18 - AP そうですね。勘違いしていました。 ヌクレオチドに付いた三リン酸はすべて脱リン酸酵素で外れます。 それは、PCR産物をシークエンス反応の鋳型にする前処理で、ExoSAPを使ってフリーのdNTPのリン酸基を除去して伸長基質にならないようにすることからも分かりましょう。

(無題) 削除/引用 No.4797-4 - 2016/01/30 (土) 16:53:54 - rna AP様 ＞IVTで作ったRNAにキャップ構造がつくわけもなし。真核生物のシステムだよな。 ご返信ありがとうございます。 私は真核生物のシステムではなく普通のin vitro transcription後のRNAの5'末端はキャップ構造なしのリン酸基が３つ付いた5'-ppp-RNAであると理解していましたが間違ってますか？ オリゴキャッピング法は知らなかったです。勉強になりました。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.4797-3 - 2016/01/30 (土) 16:39:35 - AP たとえば、完全長cDNA作成法にオリゴキャッピング法というのがあるけれど、mRNAのキャップ構造の除去と5'脱リン酸化の過程を含む。 http://dbtss_old.hgc.jp/hg16/docs/j_oligocap.html

(無題) 削除/引用 No.4797-2 - 2016/01/30 (土) 16:33:50 - AP IVTで作ったRNAにキャップ構造がつくわけもなし。真核生物のシステムだよな。

RNAの脱リン酸化 削除/引用 No.4797-1 - 2016/01/30 (土) 15:38:04 - rna いつも参考にさせていただいてます。ご指導ください。 in vitro transcriptionしたRNAの脱リン酸化を行い、最終的に5' OH-RNAにしたいのですが、一般的にクローニングなどに使うCIAPなどで行ってもいいものなのでしょうか？ 私が不安に感じている点は、transcription後は 5'-ppp-RNAのリン酸基が３つ付いている状態だと理解しているのですが、CIAPなどの脱リン酸化の説明書には『すべてのリン酸モノエステル結合を分解するが、リン酸ジエステルおよびリン酸トリエステル結合は分解しない。』と記載されています。 これは5'-ppp-RNAをCIAPで処理するとリン酸基が一つだけ外れるのか、それともリン酸基が外れる反応が続いて5'-OH-RNAになるのか、または5'pppRNAの場合は反応しないのか理解に苦しんでいるところです。 経験ある方、詳しい方どうぞ教えてください。 よろしくお願いします。

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