マウスの脾臓細胞において野生型マウスと、興味ある遺伝子のノックアウトマウス間でのカスパーゼ1の活性化を評価したいのですが、仮説としては、ノックアウトマウスの方でカスパーゼ1の過剰な活性化が認められることを予想しています。
フローサイトメトリーを用いたFLICAアッセイで評価を行ったのですが、野生型の脾臓細胞でも８割の細胞が強く染まりました。ほとんどがリンパ球だと思います。
論文では脾臓細胞は刺激無い状態ではほとんど染まらないようです。
そこで質問したいです。私のプロトコルで気になる点がありましたらご指摘いただけませんでしょうか？
1. マウス頸椎脱臼後、脾臓回収
2. PBS内にてシリンジのお尻で脾臓をマッシュし、その後100マイクロンのメッシュにてフィルター
3. 500gで遠心後、赤血球溶血液で再懸濁後、遠心
4. 0.5％ HSA in PBS内にてFLICAアッセイを行いました。
疑問：
カスパーゼ1はK＋の細胞外流出によっても活性化されることが知られていますが、赤血球溶血液（塩化アンモニウムベースの低張液）を使ったことで浸透圧刺激が起きたから野生型マウス脾臓細胞でも活性化が認められてしまったのでしょうか？
脾臓からシングルセルをラフに回収するためにシリンジのお尻で潰していましたが、そういった物理的な刺激はカスパーゼ1の活性化を引き起こしますでしょうか？
論文を探すと脾臓細胞でFLICAアッセイを行っている論文を見つけることができますが、LPSやATPとの共刺激でようやく活性化されるようなので、私の細胞が既に活性化してしまっているのだと思います。野生型とノックアウトマウス間では差はありませんでした。
このような場合、どこを疑えばいいでしょうか？またはご指摘していただけることがありましたら大変嬉しく思います。どうか宜しくお願い致します。 |
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