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(無題) 削除/引用 No.4794-3 - 2016/01/30 (土) 09:38:54 - ちゃこ おお様 ありがとうございます。 ISOGEN を用いた再精製も考えていましたが、教えて頂いた方法も合わせて、考えていきます。 試薬に頼り切って、EDTAや酸性のことを忘れていました。もっと原理を考えながら、実験しないと、と思います。

(無題) 削除/引用 No.4794-2 - 2016/01/30 (土) 02:11:58 - おお 得られたRNA溶液に扱いやすい容量になるように水を加えてクロロフォルム、エタ沈するだけでもかなりきれいになります。２６０と２８０の比はpH、EDTA存在有無などに左右され、EDTAが入っていると比較的高く２あたりになったりします。EDTA存在下では２３０との比はあまりあてにならないかもしれません。 クロロフォルム、エタ沈するまえに一度少量とって、PBSなどで希釈して吸収を確認してもいいかもしれません。このての試薬で調製したRNA溶液は水でとかした時酸性に偏っていることがおおく、それによりみかけ精製度があまりよくないように見える事が多いので。 細胞数あたりの試薬の量を増やして精製するのも限度を超えてなければ精製度を上げるのに訳には立つと思います。どの程度かはわかりません。

RNAの純度 削除/引用 No.4794-1 - 2016/01/29 (金) 20:51:23 - ちゃこ 培養細胞より、ISOGEN�Uを用いて、RNA抽出を行っています。 260/280の値が1.7-1.8台と低かったり(メーカーの推奨内ではありますが)、260/230の値が低かったりするため、どこを改善すべきか考えています。 12wellプレートにISOGEN�Uを400μL入れて、溶解させ、凍結保存。 水を入れた後とイソプロ抽出の時の遠心は13000rpm。 ラボの別の方は13000rpmでも260/280の値が2.0台が出ており、溶解時の試薬量不足を疑っています。トラブルシューティングからも同じような感じがしています。 細胞数より面積比で400μと決めてしまいました。 リアルタイムPCRで問題は出ていませんが、何となく不安が残っています。 カラム精製とDnase処理以外の改善策がありましたら、教えてください。

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