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Prescission Proteaseを使ったタグの切断と相互作用の阻害 トピック削除
No.4793-TOPIC - 2016/01/29 (金) 17:08:25 - 太郎
タンパク質のX線結晶構造解析を行いたく、実験を進めています。

目的タンパク質は、N末端にGST-tag,をつけて大腸菌で発現させています。
ただ解析の都合上、GST-tagの切断をしなくてはいけません。

しかし問題点として、Prescission ProteaseでGST-の切断を試みても、50%しか切断が起こらないということ、さらに、GST-tag切断後の目的タンパク質とGST-tagが付加されたタンパク質が２量体で相互作用をしてしまっていて、ゲルろ過等で分離ができないことです。

またなぜか、２量体形成の一方でGST-tagの切断が起こるともう一方では起こりません。

GST-tagの完全な切断方法、もしくは目的タンパク質の相互作用の阻害方法を教えていただけたらありがたいです。
よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.4793-10 - 2016/02/02 (火) 02:30:19 - おお
リンカーなどと言いましたが、C末にタグをおいてもいいかもしれません。精製に関して柔軟に対応できるならタグなしで発現させてみるのもありでしょう。

リンカーはN末に数個のアミノ酸を補って酵素がアクセスしやすくするということで、余分なアミノ酸を加えることになります。

(無題) 削除/引用
No.4793-9 - 2016/01/31 (日) 17:46:30 - 太郎
>おおさん
アシンメトリックなホモダイマーを想定しています。
GSTタグは二量体形成しているので、切れても目的タンパク質と同じフラクション画分に存在しています。

リンカー部分の工夫についてですが、
是非行いたいのですが、なにを参考にして行えばいいかわからない状態です。
何か情報等がありましたら、教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用
No.4793-8 - 2016/01/31 (日) 16:15:58 - おお
リンカーとか工夫したコンストラクトとか着手しておいたほうがいいかも。きれはGSTはどこで検出されますか？

(無題) 削除/引用
No.4793-7 - 2016/01/31 (日) 14:47:27 - おお
アシンメトリックなホモダイマーを予想していますか？

(無題) 削除/引用
No.4793-6 - 2016/01/31 (日) 13:19:23 - 太郎
>おおさん
やっぱり円濃度とpHですかね。
なるべくウレアとかはつかいたくないなとは思っています。
ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.4793-5 - 2016/01/31 (日) 13:17:43 - 太郎
>trackerさん

アグってる分けてはないと思います。
ゲルろ過で2量体形成を確認しています。

\ 削除/引用
No.4793-4 - 2016/01/31 (日) 12:53:38 - おお
一番わかり易い方法は変性させてRenatureですけど、これも蛋白によってはなかなか条件が決まらないかもしれませんね。。。

(無題) 削除/引用
No.4793-3 - 2016/01/31 (日) 12:51:38 - おお
GST自体多量体ですからねぇ。。。アグっているっぽいですねぇ。。。ON カラムでは消化できないですか？塩濃度やpHなど一応ある程度いじってみるのも手ですけど。高濃度Liとかよわいカオトロピックな作用をもつものも疎水結合を切るのに使えますけど。あとは低濃度ウレアなんか使う人もいますね。。。界面活性剤は多分あんまり使いたくないとは思いますが、、、

(無題) 削除/引用
No.4793-2 - 2016/01/31 (日) 11:23:17 - tracker
GST有り無しの2量体になっているというのはどうやって確認していますか？アグったものではないですか？
元々凝集性の強いタンパク質(あるいはドメイン)でGST融合状態では可溶化されているが、切断されると凝集してしまうとか。

Prescission Proteaseを使ったタグの切断と相互作用の阻害 削除/引用
No.4793-1 - 2016/01/29 (金) 17:08:25 - 太郎
タンパク質のX線結晶構造解析を行いたく、実験を進めています。

目的タンパク質は、N末端にGST-tag,をつけて大腸菌で発現させています。
ただ解析の都合上、GST-tagの切断をしなくてはいけません。

しかし問題点として、Prescission ProteaseでGST-の切断を試みても、50%しか切断が起こらないということ、さらに、GST-tag切断後の目的タンパク質とGST-tagが付加されたタンパク質が２量体で相互作用をしてしまっていて、ゲルろ過等で分離ができないことです。

またなぜか、２量体形成の一方でGST-tagの切断が起こるともう一方では起こりません。

GST-tagの完全な切断方法、もしくは目的タンパク質の相互作用の阻害方法を教えていただけたらありがたいです。
よろしくお願いいたします。
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