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E-cadherinの検出 トピック削除
No.4791-TOPIC - 2016/01/28 (木) 19:16:23 - yuuki
いつもお世話になります。研究初心者でぜひみなさんの知見をお聞かせ下さい。
現在、子宮頸癌細胞（SKGUやSiHa）を用いた研究を行っていますが、Western blottingにてどうしてもE-cadherinのバンドがでません。。
文献によるとE-cadherinは絶えず分解されているともありました。
E-cadherinをフルサイズで検出するために何か良い方法があれば、ぜひ御助言をお願いできれば幸いです。
宜しくお願いします。
　
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No.4791-9 - 2016/02/02 (火) 23:04:55 - おお
>[Re:8] ?さんは書きました :
> TCA固定ひつようなんてきいたことない。
> 不必要。

場合によってはこれがいいということはあります。即座に変性させるのでLysisのプロセス中のアーティファクトが減りますのでまあまあポピュラーなやり方と思いますが。ただ今回はトリプシンの影響がかなり大きいです。

細胞をスクレーパーで回収してからLysateを作るように考えているようですが、Dish上でPBSなどでよく洗ってから、氷上でLysis bufferをかけて回収してもいいかと思いました。

(無題) 削除/引用
No.4791-8 - 2016/02/02 (火) 17:31:05 - ?
TCA固定ひつようなんてきいたことない。
不必要。

(無題) 削除/引用
No.4791-7 - 2016/02/02 (火) 00:24:50 - wawa
私なら最初にTCAで固定してからwesternのサンプル調整します。

御礼 削除/引用
No.4791-6 - 2016/01/29 (金) 14:31:29 - yuuki
みなさん大変丁寧にありがとうございます。
＞おお様
検出したいE-cadherinのフルサイズは135kDaです。
たまにfragmentのようなバンドが80kDaの付近にでます。
１％SDS　bufferでのlysisをじひ試してみたいとおもいます。

＞ひよっこ様
私の細胞株ではE-cadherinは検出できるようです（報告例にありました）
アプライするタンパク量が少なすぎるのかもしれません。
御指摘のように20-40mgの間でふって実験をしてみたいと思います。

>mom様
・・・トリプシン使っていました。。。。
スクレイパーではがすようににて再度実験をしてみます。

(無題) 削除/引用
No.4791-5 - 2016/01/29 (金) 12:34:51 - mon
まさかトリプシンは使っていないと思うけど、細胞を回収する時期として、対数増殖期よりコンフルエントの方が良いかも。

(無題) 削除/引用
No.4791-4 - 2016/01/29 (金) 07:04:24 - おお
ん、短いものが検出されているってことではないのね。。。

がんばれ 削除/引用
No.4791-3 - 2016/01/29 (金) 05:07:23 - ひよっこ
細胞によっては発現してないのもありますよ。
mda-mb-231なんかはプロモーターがメチル化されておりレプレッスされた状態ですので検出できなかったと記憶しています。
モルフォロジーが上皮っぽいセルラインをポジコンとして流し直してください。
抗体はBD社のやつがいいです。タンパク量は20-40ugあれば余裕で検出できます。

(無題) 削除/引用
No.4791-2 - 2016/01/29 (金) 02:33:59 - おお
細胞を直接サンプルバッファーや１％SDSが入ったバッファーでLysisしたりしてみましたか？
Full Lengthは具体的に期待しているサイズはいくらですか？

E-cadherinの検出 削除/引用
No.4791-1 - 2016/01/28 (木) 19:16:23 - yuuki
いつもお世話になります。研究初心者でぜひみなさんの知見をお聞かせ下さい。
現在、子宮頸癌細胞（SKGUやSiHa）を用いた研究を行っていますが、Western blottingにてどうしてもE-cadherinのバンドがでません。。
文献によるとE-cadherinは絶えず分解されているともありました。
E-cadherinをフルサイズで検出するために何か良い方法があれば、ぜひ御助言をお願いできれば幸いです。
宜しくお願いします。
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