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(無題) 削除/引用 No.4764-12 - 2016/01/26 (火) 02:19:51 - おお >[Re:9] actnさんは書きました : >したことがありますが、そのときもバンドは確認できませんでした。しかし、初めてのウエスタンブロットで、しかも2回しか行ったことがないので、絶対ウエスタンで出ないとは言い切れません。SDSでバンドが見えなくても、ウエスタンならバンドが見えるということはあるんでしょうか？ CBBなどの検出感度にくわえ夾雑物がある中でのその中での一つのバンドを見極めるのに必要な量とWBの検出感度を比べればすぐわかると思います。理想的な数字を並べると1000倍感度が違うとおもいますが。 > > >バンドとして目に見える程度のタンパク質の発現が必要なのかどうかも考える必要があるかと思います． > なるほど、私はバンドで確認したのち、タンパク質精製を行うという順序しか考えておりませんでした。バンドを確認せずとも発現を確認出来る方法があるということでしょうか？ CBBなどの染色でバンドがわからなくても、最低WBで確認できるなら(それで十分量とおもえるなら)、精製して使えばいいでしょうといっているのだとおもいます。ないものはないので、本当になければ精製してもないです。

(無題) 削除/引用 No.4764-11 - 2016/01/25 (月) 18:41:05 - mm どうしてまずマニュアルを読まないのだろう？ https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/ecoli_gateway_man.pdf Pilot Expressionの項目をよく読みましょう。 APさんの書いてある通りですけど。

(無題) 削除/引用 No.4764-10 - 2016/01/25 (月) 17:47:26 - AP タンパク質発現をSDS-PAGEでチェックするとき、次の3群を行うことをお勧めします。 1. 大腸菌whole lysate。大腸菌を遠心集菌して適当量の1x sample bufferに懸濁したもの。 2. 大腸菌を所定の方法で溶菌した上清（可溶画分）に2x sample bufferを等量加えたもの。 3. 2で残った沈殿（不溶画分、inclusion bodyを含む）を回収した上清と当体積の溶菌バッファーに懸濁（当然溶けませんがスラリー状になるように）したものに、2x sample bufferを等量加えたもの。 以上を、常法にしたがってボイル、SDS-PAGEにかけます。 (1)はゲノムDNAで粘稠となり扱いづらく綺麗に流れないことがありますが、ボルテックス、注射針の通過などでDNAをせん断する、強く遠心して、ほんの上澄みだけを使うなどすればいいです。 まず、発現が確認されない段階では手軽な(1)で見ながら、最適化などをするといいです。その後、(2)(3)をside-by-sideでみてどの画分にどの程度いくかを見ます。もちろん1から3まで並べてみるのもいいです。 それと、ひょっとしたら最初からプレパラティブなスケールでやっているかもしれません。しかし、そうすんなりといくものでもないので、まずは小スケール（数mLから10 mLくらい）で予備実験をして、発現するかどうかやその最適条件を決めて、それからスケールアップしたほうがいいです。 サンプル用に分取する菌量を1と2で同じになるようにして（1と大腸菌量換算で等量になるように2の上清、3の懸濁液をとって）、並べれば、量的な比較もできます。

(無題) 削除/引用 No.4764-9 - 2016/01/25 (月) 16:56:52 - actn お返事遅くなりすみません。 皆様、回答ありがとうございます。 タンパクの抽出方法は、あ 様がおっしゃる通り、菌体破砕後遠心上清のサンプルをSDSで流しバンドの確認を行っています。また、スモールスケールで行う場合はソニケーションではなくボイルでサンプル調製をしています。 恥ずかしながら、インクルージョンボディの確認方法も、インクルージョンボディがSDSで確認出来る事も知りませんでした。 重ねた質問になって申し訳ありませんが、沈殿に含まれるタンパク質を確認する方法を教えていただけませんか？ ウエスタンブロットでも確認したことがありますが、そのときもバンドは確認できませんでした。しかし、初めてのウエスタンブロットで、しかも2回しか行ったことがないので、絶対ウエスタンで出ないとは言い切れません。SDSでバンドが見えなくても、ウエスタンならバンドが見えるということはあるんでしょうか？ >バンドとして目に見える程度のタンパク質の発現が必要なのかどうかも考える必要があるかと思います． なるほど、私はバンドで確認したのち、タンパク質精製を行うという順序しか考えておりませんでした。バンドを確認せずとも発現を確認出来る方法があるということでしょうか？ mon 様、ありがとうございます。log phase後期で誘導をかけたことがないので、一度試しにやってみます。 やはり、無細胞系に切り替えた方がはやそうですね。。 今でもかなり行き詰まっていますが、万策尽きたらボスに無細胞系システムを提案してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.4764-8 - 2016/01/25 (月) 12:37:34 - mon 致死性のタンパクの場合、誘導無しでOD=0.6~0.9（log phase後期：培地による）まで増殖させ、誘導時間1~3時間で回収、誘導温度は25、30、(33)、37℃あたりで試すと、目的タンパクが取れるかもしれません。ただし致死性でないタンパクより圧倒的に収量は低いので、in vitro合成の方が収量が良いかも。 場合によっては誘導前に遠心して新しい培地(栄養豊富）に交換すると収量が増えるかもしれません。 なお、Mg (1~10mM)添加は菌体収量を増やします（ある種のプロテアーゼも活性化するので目的次第）。Yeast Extract増量も効果あります。

(無題) 削除/引用 No.4764-7 - 2016/01/23 (土) 05:57:42 - おお まあin vtroの合成なども着手した方がいいのではないかというのが、率直な印象ではあります。

(無題) 削除/引用 No.4764-6 - 2016/01/23 (土) 05:55:24 - おお あ さんもかいてますが、これも判断材料がなかったので書かなかったのですが、wbで確認できるぐらいの量があればいいと思うならwbで発現を確認するといいかと思います。精製しするとかろうじてCBBで染まるぐらい取れるというケースもあります。 またほんとにインクルージョンボディを形成しているなら、そこからかなりの蛋白量が回収できるはずです。なのでまずはインクルージョンボディがあるのか確認しなさいと申し上げました。 金属はそれぞれの蛋白事情にもよるかもしれませんが、Zn fingerをもつたんぱくはZnを加えるといいという意見を聞くことがあります。

(無題) 削除/引用 No.4764-5 - 2016/01/22 (金) 11:06:41 - あ 菌体破砕遠心上清にバンドが観察されていないということでしょうか？ それとも，菌体破砕物（遠心前）にバンドが観察されていないということでしょうか？ 遠心上清と沈殿を別々のレーンでSDS-PAGEすると封入対の形成がよく分かると思います． しかしそもそもの発現が少ない場合は発現温度の変更とかではうまく行きません． また，目的の実験において，バンドとして目に見える程度のタンパク質の発現が必要なのかどうかも考える必要があるかと思います．

(無題) 削除/引用 No.4764-4 - 2016/01/22 (金) 08:17:12 - AP 抗菌性の機序に関連しているかも。

(無題) 削除/引用 No.4764-3 - 2016/01/22 (金) 08:14:38 - AP インクルージョンボディになっているならSDS-PAGEでみえるはずですね。 まあこの場合は、発現すると大腸菌が死んでしまうんでしょう。 さっさと、ちがう発現系、培養細胞系や無細胞系などに乗り換えるんですな。

(無題) 削除/引用 No.4764-2 - 2016/01/22 (金) 03:56:39 - おお >[Re:1] actnさんは書きました : > 文献やネットで調べていたのですが、インクルージョンボディを形成している可能性が一番高いと思っています。 じゃあそれをまず実験的に確認しなさい。そこまで調べたんなら確認の仕方もわかるでしょうに。といいますが、どんな蛋白の抽出方法をとっているのか書いてませんから、なんの判断材料もありません。

BL21AIでのGST融合タンパク質発現が上手くいきません。 削除/引用 No.4764-1 - 2016/01/21 (木) 20:20:14 - actn 初めてトピックをたてさせて頂きます。 長い期間タンパク質発現について悩んでいるので、ご助言いただければ嬉しいです。 大腸菌BL21AIに、植物抗菌ペプチドをライゲーションしたpDEST15ベクター（上流にGSTタグがある）を形質転換し、SDS-PAGEにてバンドチェックを行ったところ、バンドが確認できませんでした。 この抗菌ペプチドは約9kDaで、GSTの付加で約39kDaになります。 あまりこの抗菌ペプチドについては知られていないのですが、大腸菌に毒性のあるタンパクと思います。 L-アラビノースで発現誘導をかけるのですが、誘導をかけた後大腸菌の増えが目に見えて悪くなります。ネガコンの方はOD600が順調に増えていくのです。 全く同じクローニング方法で作った、違う遺伝子でも行っているのですがそっちではきちんとバンドが見られます。 アラビノースの濃度を変えてみたり、誘導後の温度を37℃、30℃、22℃、16℃と変えてみたりしているのですが、どうにも上手くいきません。 おおまかな手順は、3ml LB+抗生物質で37℃オーバーナイト振盪培養、後日希釈し、1時間ほど振盪培養してOD600が〜0.4付近になったらアラビノースを加えています。 文献やネットで調べていたのですが、インクルージョンボディを形成している可能性が一番高いと思っています。 自分がタンパク質初心者で、また研究室内でタンパク質発現をやっている人がおらず、詳しい人がいないのでとても困っています。 また、小耳に挟んだ話なのですが、発現の際培地に何かの金属をいれると上手くいくことがあると聞いたことがあります。情報が少なくて申し訳ないですが、ご存知の方おられますか？ 知識が少なく文も稚拙ですが、なにとぞよろしくおねがいします。

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