Luciferase reporter assayをするにあたり、細胞に遺伝子を導入しています。
しかし、luciferase 測定時に値がバラバラで (検出できないwellもあり)困っています。アドバイスをください。
現在luciferase reporter assayを行っています。HCT116とSW480を使ってします。6 well plate に細胞をseedし、24時間後にlipofectamine 3000を用いて、トランスフェクションしています。その後48時間後にluciferaseの値を測定しています。実験はトリプリケートで行っており、トリプリケートで値が３倍以上異なり、0の時も多々あります。
遺伝子導入時に、luciferase と同時に内部基準としてbe-ta ガラクトシダーゼをコードするベクターもco-transfectionしていますが、そちらの値は一定です。
またHT29細胞に同じベクターをエレクトロポレーションで入れています。
エレポ後6well plateに細胞をseedし、48時間後に測定しています。
HT29ではluciferaseとbe-ta ギャル共にトリプリケートで値は奇麗に揃っています。
実験は、遺伝子導入方法と細胞株以外異なる点はないことからリポフェクション以外の手技に問題はないと思います。
リポフェクションでは、1 mL/well OMEMを入れ、lipofectamine試薬とベクターの混合物を一括で作ってから100 μL/wellマイクロピペットで培地と混ぜています。
アドバイスいただけると幸いです。 |
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