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(無題) 削除/引用 No.4748-7 - 2016/01/16 (土) 02:51:46 - 999 膜タンパク質の場合はボイルしない方がいいと思います。 ボイルするとアグルので、30-60℃くらいで検討するようにしています。 リン酸化バンドが確認できないのは検討項目がありすぎて何とも言えないかと思います。 抗体が使えるかどうかを in vitro キナーゼアッセイとかで判断した方がいいのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.4748-6 - 2016/01/15 (金) 15:48:19 - おお サンプルバッファーで処理する以前のサンプル調製は問題ないのかな。。。 そんなにポイリングセンシティブではないけど、ごく一部ボイルでアグリやすい蛋白はあります。そういうのはやたら大きいところにバンドが来ることが多いです。 たまにサンプルバッファーを加えたあとの蛋白量が多すぎて蛋白が沈殿してしまうっているのがありますが、そんな場合はゲルのトップにバンドがあったり、ひどくテーリングしたりしそうですが。。。

(無題) 削除/引用 No.4748-5 - 2016/01/15 (金) 12:15:46 - 123 GAPDHのバンドが二本出のはもっとゆっくり流せばいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4748-4 - 2016/01/15 (金) 10:55:15 - 独り言 普通のタンパクなら3分でも10分でも問題ない。問題あると聞いたことはない。

(無題) 削除/引用 No.4748-3 - 2016/01/15 (金) 10:47:14 - み どの指南書か知らないけど、私も最長で１０分ボイルするけどね。 ５分でも問題なく泳動できるだろうが。 問題だと思うのならボイルの時間を３、５、７、１０、１５などとふって一緒に泳動してみれば良い。 リン酸化ウンヌンと言っているがtotalの標的蛋白がしかるべきサイズに検出されているなら凝集や分解は考えにくいのでは？ 蛋白の種類によっては凝集・多量体化は例がたくさんあるけど。 リン酸化抗体自体に問題があったり、リン酸化蛋白の検出系に問題はないのか？ 特にblocking bufferの組成は大いに影響する。

(無題) 削除/引用 No.4748-2 - 2016/01/15 (金) 10:39:15 - よっしー 3分ボイルしたものと10分ボイルしたものを用意して，比較すれば答えは出ませんか？ 掲示板で聞くよりも自分で経験した方が良いと思いますが・・・ サンプルによって結果が変わるものもあるかもしれませんし・・・

SDSサンプルバッファーでボイルする時間 削除/引用 No.4748-1 - 2016/01/15 (金) 10:32:15 - WB 些細なことなんですが、ラボに、SDSサンプルバッファーでボイルする時間を10分している人がいるんです。指南書だと3分ほどかと思います。westernのbandsも予想通りの結果が出ていないみたいで悩んでるようですが、ボイル時間が長過ぎて蛋白が壊れたりあぐったりしますかね？10分なんてどうってことないですか？ 予想通りの結果が出ないとは例えばVEGFで刺激してもリン酸化が認められないだとか、GAPDHが二本になってるとかのようなんです。

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