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測定結果 削除/引用 No.4745-7 - 2016/01/22 (金) 13:57:47 - 院生 今回の測定ではrenillaはそれほどばらつきませんでした。 むしろ新しく作ったnegative controlが少し逸脱したくらいでした（それでも3倍程度）。 negative controlに使っているDNAが濃いので、それでムラがあるのかもしれません。 いつも使っている物は3.9µg/µlで500µlほどあります。 何回かまたtryしてみます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.4745-6 - 2016/01/19 (火) 12:41:48 - 院生 おおさん ありがとうございます。 ひとまずnegative controlのDNAを別の物にして本日tryしてみました。 一応、今まで使っていたnegative controlも使って比較してみようと思います。 最終的にはCRISPRと同じベクターをcontrolに使ってみます。 2日後に測定する予定なので、また報告させていただきます。

WB re-probing 削除/引用 No.4745-5 - 2016/01/19 (火) 05:15:39 - おお >[Re:4] 院生さんは書きました : > 各wellでのDNA量はおおよそ4-5µgでそろえています。 > nagative control（target onlyのもの。2.や4.です）のrenillaの値が高いことが多いようです。 > negative controlにはDNA量をそろえるために関係ないDNAを入れていますが、それを改めてみます。 ベクターのプロモーターのバランスが変わると発現量に影響することがあります。ネガティブコントロールにCRISPRとおなじ種類の効果が期待できないベクターを使うのも手かと。 > > 同じDNAでも日によってrenillaの値に一桁単位でばらつきがでるのは、細胞のほぐし方なども関係するのでしょうか。 > firefly、renillaを測定する前にluciferaseの試薬を入れて細胞をほぐす際にピペッティングしてほぐしているのですが、泡だらけになるので完全に細胞をばらばらにできていないようにも思います。関係ないでしょうか。 使いづらいようでしたら、lysis bufferの量を増やしてもいいかもしれません。濃度が少ない結果、実測値が減るでしょうけどそう言う場合であれば5000もカウントがあれば信用できると思います。 > > ratioがある程度同じ傾向ならばrenillaの値はそこまで気にしなくても良いのでしょうか。 > > まとまらなくてすみません。よろしくお願いします。 transfection効率がかわるとばらつきが大きくなって傾向がつかめなくなる場合もありますけど、一定の傾向があるならそれでよしとしてもいいでしょう。 ただ一定の傾向があることをある程度しっかりしたものにするためにちょっと、実験数を増やした方がいいかもしれません。CRISPRの発現量も変わっていれば効果もぶれたりするかもしれませんよね。 ネガティブコントロールでたかいなら、CRISPRのoff targetの効果を見ている可能性はないかな。。。

(無題) 削除/引用 No.4745-4 - 2016/01/18 (月) 10:57:58 - 院生 各wellでのDNA量はおおよそ4-5µgでそろえています。 nagative control（target onlyのもの。2.や4.です）のrenillaの値が高いことが多いようです。 negative controlにはDNA量をそろえるために関係ないDNAを入れていますが、それを改めてみます。 同じDNAでも日によってrenillaの値に一桁単位でばらつきがでるのは、細胞のほぐし方なども関係するのでしょうか。 firefly、renillaを測定する前にluciferaseの試薬を入れて細胞をほぐす際にピペッティングしてほぐしているのですが、泡だらけになるので完全に細胞をばらばらにできていないようにも思います。関係ないでしょうか。 ratioがある程度同じ傾向ならばrenillaの値はそこまで気にしなくても良いのでしょうか。 まとまらなくてすみません。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.4745-3 - 2016/01/16 (土) 13:49:00 - 院生 おおさん ありがとうございます。データを再度確認してみます。 ちなみに、各実験ごとにもそれぞれrenillaの値がばらつくのですが、 その時々の細胞数やtransfectionの効率にもよるのでしょうか。 具体的には 1. 10000 2. 30000 3. 8000 といったrenillaの値が、別の日には 1. 5000 2. 40000 3. 30000 というようになります。 1-3.で入れたDNAは同じで、細胞数もそろえています（そのつもりです）。 思いあたる点があれば教えていただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.4745-2 - 2016/01/15 (金) 00:12:23 - おお DNAの濃度が正確にはかれてなくって、各Wellで総DNA量がそろってない。 DNAの純度がまちまちで汚いDNAが足を引っ張っている。 いつも同じやつが低いとか同じものを含むものが低いとかないでしょうか？

ルシフェラーゼアッセイでのレニラ生データのばらつき 削除/引用 No.4745-1 - 2016/01/14 (木) 19:04:37 - 院生 質問させてください。 CRISPRを用いてtargetのDNAを切る活性の有無を見ており、 PromegaのDual-Glo Luciferase Assay Systemを使っています。 off targetの切断効率を見るために、 1. target + CRISPR 2. target only 3. target(Mutant) + CRISPR 4. target(Mutant) only 5. positive control 6. cell only といった感じで見ているのですが、1.-5.の間でrenillaの値がかなりばらつきます。 ひどいときは約10倍、良いときでも2−3倍は差が出ます。 Renillaの値はある程度そろった方が良いと思うのですが、こんなにばらつくものなのでしょうか。 fireflyとrenillaのratioはおおむね予想したとおりの傾向です。5>1>>3>2=4=6といった感じです。 細胞: HEK293T taget vector: pGL4-SSA 24wellで実験しており、細胞数は2x10^5/wellで用いています。 何か原因として思い当たることなど指摘していただけるとありがたいです。 よろしくお願いします。

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