BioTechnicalフォーラム [SDSPAGE　分離ゲルを２層]

SDSPAGE　分離ゲルを２層

No.4740-TOPIC - 2016/01/13 (水) 22:49:36 - ぐるん

いつもお世話になっています。

SDS-PAGEに使用するゲルの濃度で質問です。
現在分子量が600kDaターゲットであるタンパクとローディングコントロールである分子量40kDa程度のB-アクチンの同時検出を考えております。
5％の均一ゲルでは高分子のタンパクは検出できるのですが、BPBが流れ切る前に泳動を止めているのですが、アクチンの検出ができまセんでした。
3-10％のグラジエントゲルを使用した場合にはアクチンは検出できるものの高分子タンパクのバンドがシャープにならず困っております。

均一ゲルであれば上から分離ゲル、濃縮ゲルの2層が一般的だと思います。
例えばなのですが濃縮ゲルをさらに2層（5％と12％）にしたりするのは良いのでしょうか？

両方の分子を綺麗に検出できる方法があればご教授ください。
　

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No.4740-10 - 2016/01/18 (月) 14:06:34 - TOKIO

問題なくできますよ。昔よくやっていました。

こつは1層目が固まって、重層する前に2層目(-TEMED)の液0.5mlぐらい入れて、リンスすると境界がよく馴染んだように思います。その液を吸い取って、2層目+TEMEDを加えてみてください。

昔200kDaと12kDaの蛋白を同じゲルで流す時によく使った方法です。

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No.4740-9 - 2016/01/14 (木) 22:32:00 - KK

ローディングコントロールの種類は変えられないのですか？
例えばvinculinなら120kDaなので5%の均一ゲルでも見れる大きさだったと思います。

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No.4740-8 - 2016/01/14 (木) 16:49:43 - ぐるん

みなさんありがとうございます。
分離ゲルを2層にするのが大丈夫そうなので、さっそくトライしてい見たいと思います。

>3～10％のグラジエントゲルは自作ではなく、既成ゲルでATTOのHPに載っていないのですが、それを使用しております。

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No.4740-7 - 2016/01/14 (木) 12:09:31 - yakumo

やったことありますが、特に問題ありませんでした（5と15%）。
注意点は他の方が書かれているとおりだと思います。

＞3-10％のグラジエントゲルを使用した場合には
とありますが、自作されているのでしょうか？
購入されている場合は5-20%のゲルもATTO等から出ていますし、
泳動サンプルが多ければ、商品サンプルをいろいろ試すのも手かなと思います。

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No.4740-6 - 2016/01/14 (木) 08:28:15 - TS

できるようですよ。

以前に別件で、Bioradのサポートにゲルについて問い合わせた時、
その方法を教えてもらいました。
付け加えられたことは、濃度の異なる境界のあたりは、泳動が乱れやすかったり、転写効率が悪くなりますとのことでした。

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No.4740-5 - 2016/01/14 (木) 00:12:03 - 独り言

分離ゲルを二層にして行っても全然もんだいありません。
しいて言えば、境目に目的のタンパク質がくるとバンドが乱れるかもしれないので、それだけ気をつければ、２層でも普通に分離できます。

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No.4740-4 - 2016/01/14 (木) 00:00:14 - おお

そういうのやってないかなってここで聞いたことがあるけど、どなたかリファレンスくれた気がする。今時間がないので、、、